第三章_微载体培养技术

表4－1 微胶囊制备材料
来源 天然
类型
脂质 多糖
材料
卵磷脂、神经鞘髓磷脂等 海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、淀粉等
蛋白质 明胶、白蛋白、纤维蛋白 纤维素类 羧甲基纤维素钠、已基纤维素、醋 半合成 衍生物 酸纤维素及其酯等 可降解型 酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸 合成
乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚内酯、聚
●收获细胞：首先排干培养液，至少用
缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快
速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后
解离收集细胞及其产品。
●微载体培养的放大：可以通过增加微
载体的含量或培养体积进行放大。使用 异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰 素，已被放大至4000L以上。
Marc145细胞微载体培养第1天
Marc145细胞微载体培养第2天
Marc145细胞微载体培养第3天 微载体上细胞基本长 满，细胞形态健康
细胞形态饱满、 生长良好
细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量 明显增加，少量微载体上细胞几乎长满
Marc145细胞微载体培养第4天
微载体上细胞更加致密，细胞 密度达到5×106个/ml以上
Marc145细胞微载体培养第10天
非降解型 聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙 烯等
制备方法
通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时 停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时， 维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体 培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。
以聚己内酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸 聚乳酸共聚物（PGLA）为基质制备可生物降解微载体 搅拌速率越大，制得的微球越小， 聚合物浓度越大，制得的微球较大
第三章 微载体培养技术
（microcarrier culture technique）
一、何谓微载体？
指直径60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。
一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。
如何增加细胞生长的贴壁面积？
最初采用在培养液中加入一定数量的小滚瓶， 增加细胞生长的贴壁面积。
此方法构造简单，成本低，重复性好，放 大过程可依靠滚瓶数量的增加。 但产率低，劳动强度大，占空间大。
3、90年代以来, 医学界开始尝试以微胶囊作为基因 重组细胞的免疫隔离和运载工具, 利用重组细胞
的代谢产物调节机体生理功能, 治疗相关疾病。
微囊化人胰岛 培养15d
微囊化肝癌细胞 培养40d
微囊化小牛肾上腺 嗜铬细胞 培养10d
4、目前，微胶囊的应用研究涉及药物控制释放、 动植物细胞培养、细胞和酶的固定化以及生化 物质分离等领域, 已经成为材料、化学、化工、 生物和医学等多学科领域工作者的研究热点。
4、细胞在微载体表面的生长的影响因素
细胞方面：细胞群体、状态和类型。
微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和离子； 微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。 培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废 物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条 件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。
微载体上细胞依然良好， 没有明显细胞脱落现象
四、微载体培养优点
●表面积/体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；
●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；
●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；
●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；
●培养基利用率较高； ●放大容易； ●细胞收获过程不复杂； ●劳动强度小； ●培养系统占地面积和空间小。
SEM下微胶囊的显微形貌 ×200
LSCM下微胶囊表面形貌的照片
不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM 照片
不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的SEM 照片
三、性质：
曾是酶固定化技术中的一种（半透膜将酶包 裹在球状的微囊里，酶及大分子不能从微囊里透 出，而小分子物质可自由通过膜）。 动物细胞微囊化后，与游离细胞相比，降低 了培养时对细胞的剪切力，同时也能提供很高的 细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。 动物细胞微囊化培养的成功为干扰素、乙肝 表面抗原(HBsAg)、单克隆抗体(MAb)等的产生提 供了广泛应用前景。
搅拌叶轮
微载体培养装置图
●
微载体的大小：增大单位体积内表面积
（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直 径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。
●
微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，
随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。
●
微载体的表面电荷：据研究，控制细胞
贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。 若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷 密度过大，反而会产生“毒性”效应。
关于H1N1疫苗生产
传统方法——疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养 生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、 劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。 如今——大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗成为可能
Baxter Biomedical研究中心， 奥地利
驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养 基内生长。中试生产中最终的生物反应器规模是1200升。 包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大 到生产体积为6000升。
多孔载体制备的材料选择
主要考虑生物相容性、机械稳定性和热稳定性 (1)生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁 细胞有良好的黏附作用； (2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破 碎；同时满足微载体清洗处理、 回收利用的要求。 (3)热稳定性：在121 ℃ 、蒸汽灭菌下不分解、 不破碎、不软化。
不同种类聚酯的微球表面形貌差异
PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞， PGLA微球表面光滑
多孔载体培养 优点:
•降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大， 免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量， 强化传质； •多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细 胞的固定化连续灌流培养； •多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和 损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移 到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养 简单，特别适合于反应器大规模培养。
二、微载体的商品类型
第一种微载体：
Van Wezel用DEAE-Sephadex A50研制而来
市售（国际）种类有十几种以上：
液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、 PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载 体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等
常用商品化微载体有三种： Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline
3、细胞与微载体的相融性： 与微载体表面理化性质有关。一般细胞 在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微 载体带正电荷，则利用静电引力可加快细 胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电 斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶 有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒 介时，则带负电荷的细胞也能贴附。
细胞（Vero和MCC）在不同外源基质处理的（Cytodex-3）微载体上贴附 (a)MCC细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(b)MCC细胞，用纤粘连蛋 白处理后的Cytodex-3表面 (c)Vero细胞，未经处理的Cytodex-3表面； (d) Vero细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3表面(e) Vero细胞， 用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3表面
微载体系统培养细胞的步骤：
(1)选择合适的微载体类型 (2)浸泡水化及消毒
(3)接种 (4)培养观察与细胞记数 (5)消化
(6)分离细胞
(7)传代培养
微载体基质
交联葡聚糖为基质微载体 纤维素为基质微载体 蛋白质为基质微载体（变性胶原微 载体:蛋黄色，表面特性好，易与 细胞结合） 高分子材料为基质微载体 无机玻璃基质微载体
至工作体积，并且增加搅拌速度保证完 全均质混合。
●培养维持期：
进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定 及细胞形态镜检； 随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增 加搅拌速率； 经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液： 停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体 积的培养液，缓慢加入新鲜培养液 （37℃），重新开始搅拌。
贴壁依赖性细胞在微载体表面上：
细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层； 贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静 电引力和范德华力； 细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接 触概率和相融性。
Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化
2、搅拌转速：
动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，无法 靠提高搅拌转速来增加接触概率。
应是非刚性材料； 不吸收培养基中的营养成分； 收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化； 价廉，能重复使用。
三、微载体培养原理与操作
1、原理：
将对细胞无害的颗粒—
—微载体加入到培养容器的
丝网 微载体
培养液中，作为载体，使细
胞在微载体表面附着生长，
通气的培养基
鼓泡器
同时通过持续搅动使微载体
始终保持悬浮状态。
微载体系统
微载体培 养系统
脊髓灰质炎、狂 犬和乙脑等疫苗
• 1967年被用于动物细胞大规模培养。 • 兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。 • 现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。
培养4h，微载体间的细 胞“桥联” ×200
电镜下串在一起的 肝细胞微载体×730
由于肝细胞的粘附作用微载 体形成“串珠” ×400
显微镜下的高密度微载体
优良的微载体应具有的特性
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不含能毒害细胞的成分； 微载体须与细胞有良好的相容性； 密度应略大于培养基； 粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250 μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm； 良好的光学透明性； 能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌；