鸡胚细胞的微载体培养
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
实验三、鸡胚细胞的原代培养
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：也叫初代 培养，指直接从体内取出的细胞、组织 和器官进行的第一次的培养。在首次传 代前的培养可认为是原代培养。原代培 养的细胞生长比较缓慢。
原代培养
• 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未 发生很大变化，在一定程度上能反映体内状 态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情 况下，采用原代培养做各种实验，如药物测 试、细胞分化等，效果很好。
• 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手要 用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试。
• 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用 盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能 暴露过久，以免溶液蒸发。
• 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐 热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧 灼时间不能太长，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧 焦形成碳膜。
• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持
物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物表 面。各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
• 游离期：
• 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆 球形。
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润；
• B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
实验一——鸡胚成纤维细胞的培养PPT课件
拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾 倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低 于瓶底；倾倒液体时两瓶口之间不能接触。
瓶内是严格无菌的，所以要保证吸管不接触到 瓶口的外壁。若一旦接触，更换新的吸管。
1 5
3
实验材料
预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液 (0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液)；DHanks平衡盐溶液；
灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个； 巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪
刀1把； 碘酒，75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。
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实验设备
（1） 37℃-CO2培养箱 （2）倒置显微镜 （3）超净台
5.培养 于37℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成 单层细胞。
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实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况；
2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细 菌污染。
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注意事项
1. 切割组织块时务必要切成小块 2. 整个操作过程要严格保持无菌 3.严格控制胰酶消化时间 4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期 和组别 1 5. 实验用品放回原处，摆放整齐
2
无菌操作的一般要求
用75％酒精擦拭消毒双手。 超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭擦净。 打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用
超净台时，打开风机，点燃酒精灯。
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严格在酒精灯无菌范围之内操作。 使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端
安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水 瓶或试管内。 操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品， 如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。
微载体培养技术(microcarrier culture technique)
微载体培养技术（microcarrier culture technique）一、微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。
经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。
目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、V ero细胞、CHO细胞。
使用较多的反应器有两种：德国贝朗生物反应器BIOSTA T Bplus ，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；美国NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift 双筛网搅拌系统。
两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
二、微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。
一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。
自V an Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。
常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。
●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。
使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。
●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。
●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。
若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。
三、微载体培养原理与操作1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。
动物细胞大规模培养技术
大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。
第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。
随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。
自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。
鸡胚的实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
鸡胚成纤维细胞的制作与培养 (2)
• 3.洗涤： • 取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用3-5mL的
Hanks液反复清洗3次，吸去胰酶，吸干上清液，留组织块。
• 4.吹打： • 加2mL含血清DMEM培养液，以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时
可见营养液混浊，即为细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。
胞培养瓶中，轻轻均匀（注意不要溢到瓶盖）。盖好瓶塞，置37℃温箱 进行培养。在瓶上注明组别，日期，4h后细胞即可贴壁，24~36h生长 成单层细胞，此时可更换培养液，并接种病毒。
注意事项
• 细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用 蒸馏水冲洗3次，再用双蒸水冲洗3次，干燥后灭 菌备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品 试剂要用分析纯试剂，严格要求无菌操作。
2.消化：
• 先将胰酶放在37℃温箱中预热。
• 将组织块移到三角瓶中，加入量约3~5倍的 0.25%胰酶（一个鸡胚约5mL胰酶），然后将 三角瓶放入水浴箱中消化约15-30min左右，每 隔5min轻轻摇动和观察一次，由于胰酶作用， 使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变 混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内 而不易下沉时或组织块棱角变模糊则需中止消化。 如再继续消化下去，可破坏细胞膜而不易贴壁生 长（细胞死悼），如果消化不够，则细胞不易分 散。
将组织块移到三角瓶中加入量约35倍的025胰酶一个鸡胚约5ml胰酶然后将三角瓶放入水浴箱中消化约1530min左右每隔5min轻轻摇动和观察一次由于胰酶作用使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离待液体变混而稍稠此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时或组织块棱角变模糊则需中止消化
实验八
鸡胚成纤维细胞的制 作与培养
• 实验目的：了解原代细胞培养的原理，掌握鸡胚 成纤维细胞的体外培养方法。
MDCK细胞及其微载体培养技术研究进展
MDCK细胞及其微载体培养技术研究进展摘要：疫苗是预防和控制禽流感的重要手段。
传统禽流感疫苗采用鸡胚制备，此方法受很多因素的限制。
传代细胞系如MDCK细胞、Vero细胞、RER.C6细胞等也被用作制备流感疫苗。
MDCK细胞以其优越的性能成为流感疫苗生产的理想细胞系。
本文将就MDCK细胞培养及其微载体培养技术研究进展进行了概述。
关键字：MDCK细胞；微载体培养禽流感是人类至今不能有效控制的传染病之一，一直是威胁禽类安全的首要疾病。
目前最主要也是最有效的控制方法就是疫苗接种。
禽流感疫苗传统生产使用鸡胚，而且是疫苗生产中的一种主要方法，但此种方法在疫病大规模爆发的情况下，很容易受限于可靠的鸡胚的来源、较长的培养周期、繁琐的操作步骤以及很容易受污染等因素。
除了传统的鸡胚制备流感疫苗，细胞培养流感病毒的技术相对鸡胚培养流感病毒来进行疫苗生产有明显优势，如生产周期较短，封闭的生物反应器更利于生产控制，更容易扩大生产规模，无过敏源和不存在鸡胚内源性病毒污染等。
传代细胞系如MDCK细胞、Vero细胞、RER.C6细胞等也被用作制备流感疫苗。
MDCK细胞具有易培养、对多种不同亚型的流感病毒株敏感、病毒用MDCK细胞培养的产量高等特点，是作为流感疫苗生产的理想细胞系。
为了适应扩大化的工业生产的需要，细胞微载体培养技术已经在工业生产上日益成熟，本文就此项技术进行了概述，并对此技术在疫苗生产中的应用作了展望。
一、MDCK细胞1958年，Madin和Darby在健康的雄性可卡猎犬的肾脏中分离了上皮样细胞并建立了Madin-Darby canine kidney（MDCK）细胞系[41]。
通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。
目前，MDCK细胞系广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒(Reovius)、腺病毒(Adenovirus)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、猫粒细胞缺乏症病毒(Feline panleukopenia virus，FPLV) 及禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 等[2-5]。
第三章 细胞培养专用微载体
4．以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养。
5．细胞培养技术：就是选用最佳生存条件对活细胞 进行培养和研究的技术。 6．动物细胞培养技术：从动物体内取出细胞或者组 织，分散成单个细胞，模拟体内的生理环境，在 无菌、适温和丰富的营养条件下，让其在体外的 培养瓶或培养基上继续生长和增殖的技术 。
动物细胞培养技术的发展史
萌芽实验：
（1）1885年，德国人W Roux把鸡胚组织放在温热的盐 水中维持其存活了10天。
（2）1887年，Arnold把白细胞收集在盛有盐水的小碟 子里，观察到白细胞的运动，并存活了一段时间。
实验缺陷：由于当时的培养基不理想，实验难以重复， 不能断定观察到的是真正存活的健康组织或细胞。
细胞培养技术的快速发展阶段
（1）20世纪40年代抗生素的发展、无菌技术的 成熟，为动物细胞规模化的培养奠定了基础。
（2）1962 年，以Capstick等成功进行BHK细胞 （幼年仓鼠肾细胞）的悬浮培养为标志，动物细 胞进入了规模化生产阶段， 发展至今已成为生物、 医学研究和应用中广泛采用的技术方法。
第三章 细胞培养专用微载体
有关细胞培养的基本概念
1．细胞培养(Cell culture) ：细胞（包括单个细胞）在体外条 件下的生长。 2．组织培养（Tissue Culture）：是指从体内取出组织和细 胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件 下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 3．器官培养（Organ Culture）：指的是应用和组织培养相 似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官， 使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT B反应器，使 用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两 种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
微载体培养技术在生物医药领域的应用
沈武玲， 王家敏， 于国伟．微载体培养技术在生物 医药领域 的应用［ ］ Ｊ ．江苏农 业科学，０ ２，０ ８ ：３— ５ ２ １ ４ （ ）４ ４
． ３． － — —４ － — —
微载体培养技术在生 物医药 领域 的应 用
沈武玲 ， 家敏 ，于 国伟。
染 ， Ｃ ｔ ｅ 系 列 应 用 最 广 。然 而 实 心 微 载 体 培 养 细 胞 以 ｙ ｄｘ ｏ
时， 细胞易受搅拌 、 间碰撞 、 珠 流动剪切力 等动力学 因素破坏 。 为克服这些缺点 ， 科学家 研制 出了 Ｃ ｔｐｒ ｙｏｏｅ系列 的多孔微 载 体， 这类微载 体 以纤 维素 为 基质 ， 用成 孔 剂 （ 糖类 、 利 盐、 冰 晶） 出法 和气体 （ Ｏ ） 泡法 制孔 ， 析 Ｃ ：发 使其 内部 形成 网状结 构， 细胞接种后容易进入微载体 内部生长分裂 ， 从而避免剪切
形多孔微载体 ， 并将其 用于肝 细胞培养 。鉴于 固体微载体 ］
有 吸附血 清、 易变性 、 次性使用 、 一 培养后分离 中细胞损失等 缺点 ， ｈｒ ｓ 开发 了氟碳 化合物 液膜 微载体 ， Ｃａ ｅ等 ｌ 这种 液体 微载体 的微珠形成 、 细胞贴壁 、 培养均在搅 拌下进行 ， 达到培
肌细胞等研究领域 已经取得 阶段性成果。肝脏是脏器再造领
域研 究最早 的脏器 之一 ，Ｏ世纪 ９ ２ ０年代初 期 国外科 研人 员 就开展了大量 的肝细胞 大规模培养研究。微载体肝细胞培养 法的主要优点在于可增大培养 面积 ， 明显 提高肝细胞 培养密 度（ １×１ 爪／ ） ０ Ｌ 。许多学 者致力于研 究利用不 同材料 制备 微载体 ， 以获得更适 合肝细胞生长 的微载体 。由于传 统方瓶 培养很难扩增人骨髓间充质细胞 ， 韩宝三等利用 Ｃｔｄｘ３微 ｙ ｅ ｏ 载体成功培养 了该细胞 ， 所收获细胞活力较好 。
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
鸡胚成纤维细胞培养doc
一、鸡胚成纤维细胞的体外培养鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。
孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。
（一）实验材料1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。
孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。
每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。
箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。
鸡胚的孵化期为2ld。
孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。
孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。
也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。
2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。
用Hanks 液或HEPES液配制。
3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。
4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。
（二）操作步骤1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。
用一已消毒金属器具将受精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。
开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。
用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。
2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的三角瓶或15ml血清瓶内。
3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。
4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。
加入少量血清钝化胰蛋白酶。
然后通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。
5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养[实验材料]9～10日龄鸡胚，Hank”s液50mL,0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL （内含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座,95％酒精，水浴锅。
[实验内容及操作程序]1．配液制备细胞前先在Hnak”s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2~7．4,将胰蛋白酶调整pH7．6（玫瑰红色).置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中.剪去头部、翅爪及内脏，用Hank”s液（简称H液）洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块,加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶,按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞,以免CO2挥发及污染。
37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液,用10mL Hank”s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或:MEM培养液,以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。