第三章微载体培养技术

常用商品化微载体有三种： Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline
显微镜下的高密度微载体
优良的微载体应具有的特性
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不含能毒害细胞的成分； 微载体须与细胞有良好的相容性； 密度应略大于培养基； 粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250 μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm； 良好的光学透明性； 能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌；
2、“人工细胞” ——“人工胰腺” 80年代初, Lim等人将微囊化技术与组织细胞 移植相结合, 制备了海藻酸钠/聚赖氨酸(APA)微胶 囊, 包埋猪胰岛细胞形成“人工细胞”, 并移植入 糖尿病大鼠体内, 结果成功地调节了血糖水平, 代 行了大鼠胰腺功能, 因而被称为“人工胰腺”。该 成果较好地解决了组织细胞移植过程的免疫排斥问 题, 避免或减少了昂贵的免疫抑制剂的使用, 为组 织细胞移植治疗神经/内分泌系统疾病提供了新思 路。
微载体系统培养细胞的步骤：
(1)选择合适的微载体类型 (2)浸泡水化及消毒
(3)接种 (4)培养观察与细胞记数 (5)消化
(6)分离细胞
(7)传代培养
微载体基质
交联葡聚糖为基质微载体 纤维素为基质微载体 蛋白质为基质微载体（变性胶原微 载体:蛋黄色，表面特性好，易与 细胞结合） 高分子材料为基质微载体 无机玻璃基质微载体
营养物质
微胶囊膜
细胞
生物大分子 代谢产物
图4－1
微胶囊示意图
二、研究发展历程
1、首次报道生物活性物质的微囊化研究（1957）： 将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包封 在选择性透过膜中，形成球状微胶囊, 称之为 “生物微胶囊”。通过微胶囊膜的选择透过作 用, 使囊外大于某一分子量的物质不能扩散进 入, 而生物环境中的营养成分和囊内生物活性 物质或细胞分泌的小分子产物可以自由出入微 胶囊, 从而达到免疫隔离目的。
3、细胞与微载体的相融性： 与微载体表面理化性质有关。一般细胞 在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微 载体带正电荷，则利用静电引力可加快细 胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电 斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶 有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒 介时，则带负电荷的细胞也能贴附。
细胞（Vero和MCC）在不同外源基质处理的（Cytodex-3）微载体上贴附 (a)MCC细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(b)MCC细胞，用纤粘连蛋 白处理后的Cytodex-3表面 (c)Vero细胞，未经处理的Cytodex-3表面； (d) Vero细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3表面(e) Vero细胞， 用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3表面
至工作体积，并且增加搅拌速度保证完 全均质混合。
●培养维持期：
进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定 及细胞形态镜检； 随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增 加搅拌速率； 经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液： 停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜 体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液 （37℃），重新开始搅拌。
多孔载体制备的材料选择
主要考虑生物相容性、机械稳定性和热稳定性 (1)生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁 细胞有良好的黏附作用； (2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破 碎；同时满足微载体清洗处理、 回收利用的要求。 (3)热稳定性：在121 ℃ 、蒸汽灭菌下不分解、 不破碎、不软化。
非降解型 聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、
聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙 烯等
贴壁依赖性细胞在微载体表面上：
细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层； 贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静 电引力和范德华力； 细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接 触概率和相融性。
Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化
2、搅拌转速：
动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，无法 靠提高搅拌转速来增加接触概率。
4、细胞在微载体表面的生长的影响因素
细胞方面：细胞群体、状态和类型。
微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和离子； 微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。 培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废 物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条 件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。
此方法构造简单，成本低，重复性好，放 大过程可依靠滚瓶数量的增加。 但产率低，劳动强度大，占空间大。
微载体系统
微载体培 养系统
脊髓灰质炎、狂 犬和乙脑等疫苗
• 1967年被用于动物细胞大规模培养。 • 兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。 • 现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产 品。
培养4h，微载体间的细 胞“桥联” ×200
流感疫苗生产的大规模生产区域
(A) 细胞培养 (B) 离心分离(C) 超滤、洗滤。
大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片 (A) 未感染的细胞 (B) 早期细胞病变 影响 (C) 收获前的晚期细胞病变
Vero细胞流感疫苗生产图
本章讲授到此，谢谢！
回想一下：
何谓微载体？ 指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞 生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种 合成的聚合物组成。
SEM下微胶囊的显微形貌 ×200
LSCM下微胶囊表面形貌的照片
不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM 照片
不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的SEM 照片
三、性质：
曾是酶固定化技术中的一种（半透膜将酶包 裹在球状的微囊里，酶及大分子不能从微囊里透 出，而小分子物质可自由通过膜）。 动物细胞微囊化后，与游离细胞相比，降低 了培养时对细胞的剪切力，同时也能提供很高的 细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。 动物细胞微囊化培养的成功为干扰素、乙肝 表面抗原(HBsAg)、单克隆抗体(MAb)等的产生提 供了广泛应用前景。
Marc145细胞微载体培养第2天
Marc145细胞微载体培养第3天 微载体上细胞基本长 满，细胞形态健康
细胞形态饱满、 生长良好
细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量 明显增加，少量微载体上细胞几乎长满
Marc145细胞微载体培养第4天
微载体上细胞更加致密，细胞 密度达到5×106个/ml以上
Marc145细胞微载体培养第10天
表4－1 微胶囊制备材料
来源 天然
类型
脂质 多糖
材料
卵磷脂、神经鞘髓磷脂等 海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、淀粉等
蛋白质 明胶、白蛋白、纤维蛋白 纤维素类 羧甲基纤维素钠、已基纤维素、醋 半合成 衍生物 酸纤维素及其酯等 可降解型 酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸 合成
乳酸/乙醇酸共聚物、聚正酯、聚内酯、聚
鼓泡器
搅拌叶轮
微载体培养装置图
●
微载体的大小：增大单位体积内表面积
（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直 径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。
●
微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，
随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。
●
微载体的表面电荷：据研究，控制细胞
贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。 若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷 密度过大，反而会产生“毒性”效应。
●收获细胞：首先排干培养液，至少用
缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快
速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后
解离收集细胞及其产品。
●微载体培养的放大：可以通过增加微
载体的含量或培养体积进行放大。使用 异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰 素，已被放大至4000L以上。
Marc145细胞微载体培养第1天
关于H1N1疫苗生产
传统方法——疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养 生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、 劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。 如今——大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗成为可能
Baxter Biomedical研究中心， 奥地利
驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养 基内生长。中试生产中最终的生物反应器规模是1200升。 包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大 到生产体积为6000升。
微载体上细胞依然良好， 没有明显细胞脱落现象
四、微载体培养优点
●表面积/体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；
●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；
●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；
●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；
●培养基利用率较高； ●放大容易； ●细胞收获过程不复杂； ●劳动强度小； ●培养系统占地面积和空间小。
原理：
将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养 容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载 体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载 体始终保持悬浮状态。
第四章 动物细胞的微囊化培养
一、微囊法（microencapsulation）:
用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状
的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及
营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小 培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少 受损伤，故细胞生长好、密度高。
电镜下串在一起的 肝细胞微载体×730
由于肝细胞的粘附作用微载 体形成“串珠” ×400
二、微载体的商品类型
第一种微载体：
Van Wezel用DEAE-Sephadex A50研制而来
市售（国际）种类有十几种以上：
液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、 PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微 载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等
第三章 微载体培养技术
（microcarrier culture technique）
一、何谓微载体？
指直径60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的 微珠。 一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组 成。
如何增加细胞生长的贴壁面积？
最初采用在培养液中加入一定数量的小滚瓶， 增加细胞生长的贴壁面积。
3、90年代以来, 医学界开始尝试以微胶囊作为基因 重组细胞的免疫隔离和运载工具, 利用重组细胞
的代谢产物调节机体生理功能, 治疗相关疾病。
微囊化人胰岛 培养15d
微囊化肝癌细胞 培养40d源自微囊化小牛肾上腺 嗜铬细胞 培养10d
4、目前，微胶囊的应用研究涉及药物控制释放、 动植物细胞培养、细胞和酶的固定化以及生化 物质分离等领域, 已经成为材料、化学、化工、 生物和医学等多学科领域工作者的研究热点。
应是非刚性材料； 不吸收培养基中的营养成分； 收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化； 价廉，能重复使用。
三、微载体培养原理与操作
1、原理：
将对细胞无害的颗粒—
—微载体加入到培养容器的
丝网 微载体 通气的培养基
培养液中，作为载体，使细
胞在微载体表面附着生长， 同时通过持续搅动使微载体 始终保持悬浮状态。
5、微载体培养操作要点
●培养初期： 保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平， 接种细胞（对数生长期）至终体积1/3的培养液 中，以增加细胞与微载体接触的机会。 不同的微载体所用浓度及接种细胞密度不同，
常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓
度需要控制环境或经常换液。
贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液
不同种类聚酯的微球表面形貌差异
PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞， PGLA微球表面光滑
多孔载体培养 优点:
•降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大， 免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量， 强化传质； •多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细 胞的固定化连续灌流培养； •多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和 损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移 到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养 简单，特别适合于反应器大规模培养。
通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅 时停；数小时后，待细胞附着于微载体表 面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。 微载体培养的搅拌非常慢，最大速度 75r/min。
以聚己内酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸 聚乳酸共聚物（PGLA）为基质制备可生物降解微载体 搅拌速率越大，制得的微球越小， 聚合物浓度越大，制得的微球较大