第三章微载体培养技术演示文稿

以聚己内酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸 聚乳酸共聚物（PGLA）为基质制备可生物降解微载体
搅拌速率越大，制得的微球越小， 聚合物浓度越大，制得的微球较大
3、细胞与微载体的相融性：
与微载体表面理化性质有关。一般细胞 在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微 载体带正电荷，则利用静电引力可加快细 胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电 斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶 有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒 介时，则带负电荷的细胞也能贴附。
第三章微载体培养技术演示文 稿
如何增加细胞生长的贴壁面积？
最初采用在培养液中加入一定数量的小滚瓶， 增加细胞生长的贴壁面积。 此方法构造简单，成本低，重复性好，放 大过程可依靠滚瓶数量的增加。 但产率低，劳动强度大，占空间大。
微载体系统
微载体培 养系统
脊髓灰质炎、狂 犬和乙脑等疫苗
• 1967年被用于动物细胞大规模培养。 • 兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。 • 现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。
保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平， 接种细胞（对数生长期）至终体积1/3的培养液 中，以增加细胞与微载体接触的机会。
不同的微载体所用浓度及接种细胞密度不同， 常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓 度需要控制环境或经常换液。
贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液 至工作体积，并且增加搅拌速度保证完 全均质混合。
●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，
随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。
●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞
贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。 若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷 密度过大，反而会产生“毒性”效应。
贴壁依赖性细胞在微载体表面上：
细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层； 贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静 电引力和范德华力； 细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接 触概率和相融性。
微载体系统培养细胞的步骤：
(1)选择合适的微载体类型 (2)浸泡水化及消毒 (3)接种 (4)培养观察与细胞记数 (5)消化 (6)分离细胞 (7)传代培养
微载体基质
➢交联葡聚糖为基质微载体 ➢纤维素为基质微载体 ➢蛋白质为基质微载体（变性胶原微
载体:蛋黄色，表面特性好，易与 细胞结合） ➢高分子材料为基质微载体 ➢无机玻璃基质微载体
常用商品化微载体有三种：
Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline
显微镜下的高密度微载体
优良的微载体应具有的特性
• 不含能毒害细胞的成分； • 微载体须与细胞有良好的相容性； • 密度应略大于培养基； • 粒径在40～120μm范围，生理盐水溶胀后增大到60~250
μm，粒度分布地均匀，径差不大于20~25μm； • 良好的光学透明性； • 能在PBS中耐120~125℃、20~30min高温灭菌； • 应是非刚性材料； • 不吸收培养基中的营养成分； • 收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化； • 价廉，能重复使用。
三、微载体培养原理与操作
1、原理：
将对细胞无害的颗粒— —微载体加入到培养容器的 培养液中，作为载体，使细 胞在微载体表面附着生长， 同时通过持续搅动使微载体 始终保持悬浮状态。
丝网 微载Leabharlann Baidu 通气的培养基 鼓泡器
搅拌叶轮 微载体培养装置图
●微载体的大小：增大单位体积内表面积
（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直 径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。
多孔载体制备的材料选择
主要考虑生物相容性、机械稳定性和热稳定性
(1)生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁 细胞有良好的黏附作用；
(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破 碎；同时满足微载体清洗处理、 回收利用的要求。
(3)热稳定性：在121 ℃ 、蒸汽灭菌下不分解、 不破碎、不软化。
5、微载体培养操作要点 ●培养初期：
4、细胞在微载体表面的生长的影响因素
细胞方面：细胞群体、状态和类型。 微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分子和离子；
微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。 培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废
物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条 件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。
Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化
2、搅拌转速： 动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，无法
靠提高搅拌转速来增加接触概率。
通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅 时停；数小时后，待细胞附着于微载体表 面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。 微载体培养的搅拌非常慢，最大速度 75r/min。
培养4h，微载体间的细 胞“桥联” ×200
电镜下串在一起的 肝细胞微载体×730
由于肝细胞的粘附作用微载 体形成“串珠” ×400
二、微载体的商品类型
第一种微载体：
Van Wezel用DEAE-Sephadex A50研制而来
市售（国际）种类有十几种以上：
液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、 PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微 载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等
细胞（Vero和MCC）在不同外源基质处理的（Cytodex-3）微载体上贴附
(a)MCC细胞，未经处理的Cytodex-3表面；(b)MCC细胞，用纤粘连蛋 白处理后的Cytodex-3表面 (c)Vero细胞，未经处理的Cytodex-3表面； (d) Vero细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3表面(e) Vero细胞， 用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3表面
不同种类聚酯的微球表面形貌差异
PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞， PGLA微球表面光滑
多孔载体培养
优点:
•降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大， 免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量， 强化传质；
•多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细 胞的固定化连续灌流培养；
•多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和 损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移 到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养 简单，特别适合于反应器大规模培养。