甲氧西林耐药_敏感金黄色葡萄球菌基因分型和毒力基因检测_王俊瑞
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中国感染与化疗杂志２０１５年１月２０日第１５卷第１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｊａｎ．２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１
·论著·
甲氧西林耐药／敏感金黄色葡萄球菌基因分型和 毒力基因检测
王 俊 瑞１ ， 杜 小 莉２ ， 塔 拉１ ， 崔 晶 花２ ， 福 泉１ ， 韩 艳 秋１
ｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ３０ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ３０ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｈｏｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ．ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ
ｔｏ ｐｒｏｆｉｌｅ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＰＦＧＥ ｔｙｐｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ６０ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ
Ｈｏｈｈｏｔ，ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＰＦＧＥ）ａｎｄ ｍｕｌｔｉ ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ （ＭＬＳＴ）ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
金黄色葡萄球 菌 （金 葡 菌），特 别 是 耐 甲 氧 西 林 金 葡 菌 （ＭＲＳＡ）目 前 已 成 为 医 院 感 染 的 主 要 病 原 菌 之 一 。 金 葡 菌 通 过 释 放 多 种 细 胞 外 毒 素 ，如 肠 毒 素 、 溶血素、杀白细胞毒素等而表现出较强的致 病 力 。 ［１］ 不同基因背景及来源金葡菌的毒力因子分布特征差 异显著［２－４］，且其表达特征明显地受宿主等环 境 因 素 的影 响 。 ［５－６］ 随 着 异 质 性 万 古 霉 素 中 介 金 葡 菌 （ｈ－ ＶＩＳＡ）检出率的增加以及万古 霉 素 耐 药 株（ＶＲＳＡ） 的出现，更严格防控 金 葡 菌 的 感 染 及 其 耐 药 性 的 产 生成为当前医院感染防控的重要内容。但耐药性的 增加与金葡菌毒力的 关 系 见 解 不 一 。 ［７－１０］ 本 研 究 拟 以 内 蒙 古 呼 和 浩 特 地 区 住 院 患 者 分 离 的 ６０ 株 ＭＲＳＡ 和甲 氧 西 林 敏 感 金 葡 菌 （ＭＳＳＡ）为 研 究 对 象，对不同耐药表型 菌 株 进 行 分 子 分 型 并 检 测 其 毒 力基因 分 布 特 征，分 析 ＭＲＳＡ 和 ＭＳＳＡ 在 基 因 型 和毒力基因分布中 的 差 异，为 进 一 步 研 究 金 葡 菌 耐 药性演变与毒力变迁之间的相关性提供参数。
摘要： 目的 分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（金葡菌）（ＭＲＳＡ）和甲氧西林敏感金 葡 菌（ＭＳＳＡ）临 床 分 离 株 基 因 分 型 及 毒 力基因分布特征是否存在差异，了解金葡菌耐药性演变与毒力变迁之间的相关 性。 方 法 采 用 脉 冲 场 凝 胶 电 泳（ＰＦＧＥ）方 法 和多位点序列分型（ＭＬＳＴ）方法对呼和浩特地区住院患 者 中 分 离 的 ３０ 株 ＭＲＳＡ 和 ３０ 株 ＭＳＳＡ 进 行 分 子 分 型，同 步 采 用 聚 合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测菌株毒力基因。结果 ６０株 金 葡 菌 ＰＦＧＥ 分 型 共 分 １９ 个 型，ＭＳＳＡ 菌 株 分 布 在Ｉ和 Ｈ 型 等 １６ 个基因型中，而 ＭＲＳＡ 株主要集中分布在 Ｋ 和 Ｍ２个基因型中。２０株不同 ＰＦＧＥ 型菌株 ＭＬＳＴ 分型结果显示，ＭＲＳＡ 株主 要为 ＳＴ－２３９型；ＭＳＳＡ 株呈多样性分布特征，主 要 以 ＳＴ－５ 型、ＳＴ－７ 型、ＳＴ－１５ 型 为 主。 毒 力 基 因 在 ＭＲＳＡ 和 ＭＳＳＡ 中 分 布 差异显著。ＭＳＳＡ 毒力基因整体携带率明显高于 ＭＲＳＡ（５３．９％对４０．０％，χ２＝３２．７，Ｐ＜０．０１）。ＭＲＳＡ 株ｓｅａ、ｃｎａ 和ｃａｐ８ 基因携带率明显高于 ＭＳＳＡ 携带率（Ｐ＜０．０１），而ｓｅｃ、ｓｅｇ、ｓｅｉ、ｓｅｍ、ｓｅｎ、ｓｅｏ、ｆｎｂＢ、ｅｂｐＳ、ｃａｐ５ 基 因 携 带 率 明 显 低 于 ＭＳＳＡ（Ｐ ＜０．０５）。结论 呼和浩特地区金葡菌临床分离 株 基 因 型 呈 现 多 样 化 分 布 特 点 ，ＭＲＳＡ 主 要 以 ＳＴ－２３９ 型 为 主。ＭＳＳＡ 毒 力 基因携带率高，特定毒力因子在 ＭＲＳＡ 和 ＭＳＳＡ 株中呈现一 定 聚 集 分 布 特 征，金 葡 菌 特 定 耐 药 性 的 获 得 可 能 伴 随 特 定 毒 力 特征的变化。 关 键 词 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ； 耐 药 性 ； 毒 力 基 因 ； 分 子 分 型 中 图 分 类 号 ：Ｒ３７８．１１ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００９－７７０８（２０１５）０１－００７０－０６
Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
ＷＡＮＧ Ｊｕｎｒｕｉ，ＤＵ Ｘｉａｏｌｉ，ＴＡ Ｌａ，ＣＵＩ Ｊｉｎｇｈｕａ，ＦＵ Ｑｕａｎ，ＨＡＮ Ｙａｎｑｉｕ． （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００５０， Ｃｈｉｎａ）
（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）购自 Ｓｉｇｍａ公司。聚合酶链反应（ＰＣＲ） ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ 购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司。 ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ 琼脂糖（ＳＫＧ）购自美国 ＬＯＮＺＡ 公司。 ＰＣＲ 引物合成及扩增产物测序由上海生物工程有限 公司完成。 １．２ 方 法 １．２．１ 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 （ＰＦＧＥ）分 型 实 验 基 本 流程参照文献［１１］进 行。 基 本 过 程 如 下：标 准 菌 株 和试验菌株常规培 养 后 配 置 一 定 浓 度 菌 悬 液，加 入 ２μＬ 溶葡萄球菌素（１ ｍｇ／ｍＬ）处 理。 等 体 积 预 热 的 ＳＫＧ 与菌悬液混 合，立 即 注 入 模 具，室 温 下 静 置 直至凝固为胶块。胶块中加入细胞裂解液混合液中 进行裂解。标准菌株胶块及试验菌株胶块分别置于 含 ＸｂａＩ内切酶缓冲液及 ＳｍａＩ限制性内切酶缓冲液 中孵育。胶块在 ＰＦＧＥ仪中进行电泳，条带比对以沙 门 菌 Ｈ９８１２ 进 行 标 准 化。 胶 块 间 图 像 比 较 采 用 ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ，Ｉｎｃ）软 件进行 处 理。采 用 １．５％ 条 带 差 异 允 许 度。聚 类 分 析采 用 ＵＰＧＭＡ（组 间 非 加 权 的 几 何 平 均 数）方 法， ＤＮＡ 相关性采用 Ｄｉｃｅ系 数 计 算。相 似 性 系 数 ９０％ 以上认为菌株间亲缘关系较近，归为一类。 １．２．２ 多 位 点 序 列 分 型 （ＭＬＳＴ） 根 据 文 献 ［１２］ 介 绍 方 法，随 机 选 取 不 同 ＰＦＧＥ 图 谱 型 ３、４ 株 ＭＲＳＡ 菌株为代表株（共２０ 株）进 行 ７ 个 管 家 基 因 （ａｒｃＣ，ａｒｏＥ，ｇｌｐＦ，ｇｍｋ，ｐｔａ，ｔｐｉ，ｙｑｉＬ）序 列 测 定。 首先对各菌 株 纯 培 养 物 进 行 ＤＮＡ 提 取 （细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提取试 剂 盒，天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ），利 用各基 因 特 异 性 引 物 进 行 ＰＣＲ 扩 增，ＰＣＲ 产 物 送 上海生工公 司 进 行 序 列 测 定。ＰＣＲ 扩 增 与 序 列 测 定使 用 同 一 对 引 物。 测 序 结 果 在 ｈｔｔｐ：／／ｓａｕｒｅｕｓ． ｍｌｓｔ．ｎｅｔ网站进 行 序 列 比 对，确 定 其 ＳＴ 型 别 并 进 行亲缘关系比对。 １．２．３ 毒力因子检 测 每 株 菌 纯 培 养 物 采 用 细 菌 基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 提 取 ＤＮＡ，用 表 １ 所 列 毒 力因子基因特异引物进行 ＰＣＲ 检测。ＰＣＲ 产物 进 行琼脂糖凝胶电泳并成像。
ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ １９ ｍａｊｏｒ ｔｙｐｅｓ．ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ １６ ｔｙｐｅｓ，ｍａｉｎｌｙ ｔｙｐｅｓ Ｉ ａｎｄ Ｈ．ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｍａｉｎｌｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ
ｔｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｋ ａｎｄ Ｍ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ２０ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＦＧＥ ｔｙｐｅｓ，ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ＳＴ－２３９ ｔｙｐｅ．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （ＭＲＳＡ）ａｎｄ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ （ＭＳＳＡ）ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ（５３．９％ ｖｅｒｓｕｓ ４０．０％，χ２＝ ３２．７，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅａ，ｃｎａ ａｎｄ ｃａｐ８ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ （Ｐ＜０．０１），
ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ＳＴｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （８１２６０２４４）。 作 者 单 位 ：１．内 蒙 古 医 科 大 学 附 属 医 院 检 验 科 ，呼 和 浩 特
０１００５０；
源自文库
ｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ＳＴ－５，ＳＴ－７ ａｎｄ ＳＴ－１５．Ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 菌 株 及 质 控 菌 株 ２０１１ 年 １２ 月—２０１４ 年 ３月内蒙古呼和浩特地区 ６０例住院患 者（入 院 时 间 ＞４８ ｈ）分离 ＭＲＳＡ３０株和 ＭＳＳＡ３０ 株 作 为 研 究 对象。 其 中，２５ 株 分 离 自 伤 口 分 泌 物，１４ 株 分 离 自 全 血 标 本 ，１０ 株 分 离 自 脓 液 标 本 ，４ 株 分 离 自 咽 拭 子 标本，３株分离自痰 液 标 本，２ 株 分 离 自 尿 液 标 本，１ 株分离自胸 腹 水，１ 株 分 离 自 关 节 腔 积 液。 所 有 金 葡菌分离株均再次 鉴 定，并 依 据 美 国 临 床 与 实 验 室 标 准 化 协 会 （ＣＬＳＩ）２０１３ 年 版 标 准 进 行 药 敏 试 验 ，采 用头孢西丁纸 片 扩 散 法 确 认 ＭＲＳＡ 株。 质 控 菌 株 金 葡 菌 （ＡＴＣＣ２５９２３）由 本 实 验 室 保 存 。 １．１．２ 主 要 仪 器 和 试 剂 ＶＩＴＥＫ－Ⅱ 全 自 动 微 生 物分析系统及 配 套 革 兰 阳 性 菌 鉴 定 卡 ＧＰ （法 国 生 物梅里 埃 公 司）、２７２０ 型 ＰＣＲ 仪 （ＡＢＩ公 司）、脉 冲 场凝胶电泳设备（美国 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公 司）。头孢西丁药 敏 纸 片 购 自 英 国 ＯＸＯＩＤ 公 司。 溶 葡 萄 球 菌 素
２．中 国 疾 病 预 防 控 制 中 心 传 染 病 预 防 控 制 所 。 作 者 简 介 ：王 俊 瑞 （１９８１— ），男 ，博 士 ，主 治 医 师 ，主 要 从 事 金 黄 色
葡萄球菌感染致病机制研究。 通 信 作 者 ：韩 艳 秋 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｙｈ１０１６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
中国感染与化疗杂志２０１５年１月２０日第１５卷第１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｊａｎ．２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１
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ｂｕｔ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｃ，ｓｅｇ，ｓｅｉ，ｓｅｍ，ｓｅｎ，ｓｅｏ，ｆｎｂＢ，ｅｂｐＳａｎｄｃａｐ５ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ（Ｐ ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｏｈｈｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ．ＳＴ－２３９ ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ＰＦＧＥ ｔｙｐｅ ｏｆ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｓ ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｓｏ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｙ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｉｎ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ
中国感染与化疗杂志２０１５年１月２０日第１５卷第１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｊａｎ．２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１
·论著·
甲氧西林耐药／敏感金黄色葡萄球菌基因分型和 毒力基因检测
王 俊 瑞１ ， 杜 小 莉２ ， 塔 拉１ ， 崔 晶 花２ ， 福 泉１ ， 韩 艳 秋１
ｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ３０ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ３０ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｈｏｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ．ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ
ｔｏ ｐｒｏｆｉｌｅ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＰＦＧＥ ｔｙｐｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ６０ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ
Ｈｏｈｈｏｔ，ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＰＦＧＥ）ａｎｄ ｍｕｌｔｉ ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ （ＭＬＳＴ）ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
金黄色葡萄球 菌 （金 葡 菌），特 别 是 耐 甲 氧 西 林 金 葡 菌 （ＭＲＳＡ）目 前 已 成 为 医 院 感 染 的 主 要 病 原 菌 之 一 。 金 葡 菌 通 过 释 放 多 种 细 胞 外 毒 素 ，如 肠 毒 素 、 溶血素、杀白细胞毒素等而表现出较强的致 病 力 。 ［１］ 不同基因背景及来源金葡菌的毒力因子分布特征差 异显著［２－４］，且其表达特征明显地受宿主等环 境 因 素 的影 响 。 ［５－６］ 随 着 异 质 性 万 古 霉 素 中 介 金 葡 菌 （ｈ－ ＶＩＳＡ）检出率的增加以及万古 霉 素 耐 药 株（ＶＲＳＡ） 的出现，更严格防控 金 葡 菌 的 感 染 及 其 耐 药 性 的 产 生成为当前医院感染防控的重要内容。但耐药性的 增加与金葡菌毒力的 关 系 见 解 不 一 。 ［７－１０］ 本 研 究 拟 以 内 蒙 古 呼 和 浩 特 地 区 住 院 患 者 分 离 的 ６０ 株 ＭＲＳＡ 和甲 氧 西 林 敏 感 金 葡 菌 （ＭＳＳＡ）为 研 究 对 象，对不同耐药表型 菌 株 进 行 分 子 分 型 并 检 测 其 毒 力基因 分 布 特 征，分 析 ＭＲＳＡ 和 ＭＳＳＡ 在 基 因 型 和毒力基因分布中 的 差 异，为 进 一 步 研 究 金 葡 菌 耐 药性演变与毒力变迁之间的相关性提供参数。
摘要： 目的 分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（金葡菌）（ＭＲＳＡ）和甲氧西林敏感金 葡 菌（ＭＳＳＡ）临 床 分 离 株 基 因 分 型 及 毒 力基因分布特征是否存在差异，了解金葡菌耐药性演变与毒力变迁之间的相关 性。 方 法 采 用 脉 冲 场 凝 胶 电 泳（ＰＦＧＥ）方 法 和多位点序列分型（ＭＬＳＴ）方法对呼和浩特地区住院患 者 中 分 离 的 ３０ 株 ＭＲＳＡ 和 ３０ 株 ＭＳＳＡ 进 行 分 子 分 型，同 步 采 用 聚 合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测菌株毒力基因。结果 ６０株 金 葡 菌 ＰＦＧＥ 分 型 共 分 １９ 个 型，ＭＳＳＡ 菌 株 分 布 在Ｉ和 Ｈ 型 等 １６ 个基因型中，而 ＭＲＳＡ 株主要集中分布在 Ｋ 和 Ｍ２个基因型中。２０株不同 ＰＦＧＥ 型菌株 ＭＬＳＴ 分型结果显示，ＭＲＳＡ 株主 要为 ＳＴ－２３９型；ＭＳＳＡ 株呈多样性分布特征，主 要 以 ＳＴ－５ 型、ＳＴ－７ 型、ＳＴ－１５ 型 为 主。 毒 力 基 因 在 ＭＲＳＡ 和 ＭＳＳＡ 中 分 布 差异显著。ＭＳＳＡ 毒力基因整体携带率明显高于 ＭＲＳＡ（５３．９％对４０．０％，χ２＝３２．７，Ｐ＜０．０１）。ＭＲＳＡ 株ｓｅａ、ｃｎａ 和ｃａｐ８ 基因携带率明显高于 ＭＳＳＡ 携带率（Ｐ＜０．０１），而ｓｅｃ、ｓｅｇ、ｓｅｉ、ｓｅｍ、ｓｅｎ、ｓｅｏ、ｆｎｂＢ、ｅｂｐＳ、ｃａｐ５ 基 因 携 带 率 明 显 低 于 ＭＳＳＡ（Ｐ ＜０．０５）。结论 呼和浩特地区金葡菌临床分离 株 基 因 型 呈 现 多 样 化 分 布 特 点 ，ＭＲＳＡ 主 要 以 ＳＴ－２３９ 型 为 主。ＭＳＳＡ 毒 力 基因携带率高，特定毒力因子在 ＭＲＳＡ 和 ＭＳＳＡ 株中呈现一 定 聚 集 分 布 特 征，金 葡 菌 特 定 耐 药 性 的 获 得 可 能 伴 随 特 定 毒 力 特征的变化。 关 键 词 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ； 耐 药 性 ； 毒 力 基 因 ； 分 子 分 型 中 图 分 类 号 ：Ｒ３７８．１１ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００９－７７０８（２０１５）０１－００７０－０６
Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
ＷＡＮＧ Ｊｕｎｒｕｉ，ＤＵ Ｘｉａｏｌｉ，ＴＡ Ｌａ，ＣＵＩ Ｊｉｎｇｈｕａ，ＦＵ Ｑｕａｎ，ＨＡＮ Ｙａｎｑｉｕ． （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００５０， Ｃｈｉｎａ）
（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）购自 Ｓｉｇｍａ公司。聚合酶链反应（ＰＣＲ） ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ 购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司。 ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ 琼脂糖（ＳＫＧ）购自美国 ＬＯＮＺＡ 公司。 ＰＣＲ 引物合成及扩增产物测序由上海生物工程有限 公司完成。 １．２ 方 法 １．２．１ 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 （ＰＦＧＥ）分 型 实 验 基 本 流程参照文献［１１］进 行。 基 本 过 程 如 下：标 准 菌 株 和试验菌株常规培 养 后 配 置 一 定 浓 度 菌 悬 液，加 入 ２μＬ 溶葡萄球菌素（１ ｍｇ／ｍＬ）处 理。 等 体 积 预 热 的 ＳＫＧ 与菌悬液混 合，立 即 注 入 模 具，室 温 下 静 置 直至凝固为胶块。胶块中加入细胞裂解液混合液中 进行裂解。标准菌株胶块及试验菌株胶块分别置于 含 ＸｂａＩ内切酶缓冲液及 ＳｍａＩ限制性内切酶缓冲液 中孵育。胶块在 ＰＦＧＥ仪中进行电泳，条带比对以沙 门 菌 Ｈ９８１２ 进 行 标 准 化。 胶 块 间 图 像 比 较 采 用 ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ，Ｉｎｃ）软 件进行 处 理。采 用 １．５％ 条 带 差 异 允 许 度。聚 类 分 析采 用 ＵＰＧＭＡ（组 间 非 加 权 的 几 何 平 均 数）方 法， ＤＮＡ 相关性采用 Ｄｉｃｅ系 数 计 算。相 似 性 系 数 ９０％ 以上认为菌株间亲缘关系较近，归为一类。 １．２．２ 多 位 点 序 列 分 型 （ＭＬＳＴ） 根 据 文 献 ［１２］ 介 绍 方 法，随 机 选 取 不 同 ＰＦＧＥ 图 谱 型 ３、４ 株 ＭＲＳＡ 菌株为代表株（共２０ 株）进 行 ７ 个 管 家 基 因 （ａｒｃＣ，ａｒｏＥ，ｇｌｐＦ，ｇｍｋ，ｐｔａ，ｔｐｉ，ｙｑｉＬ）序 列 测 定。 首先对各菌 株 纯 培 养 物 进 行 ＤＮＡ 提 取 （细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提取试 剂 盒，天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ），利 用各基 因 特 异 性 引 物 进 行 ＰＣＲ 扩 增，ＰＣＲ 产 物 送 上海生工公 司 进 行 序 列 测 定。ＰＣＲ 扩 增 与 序 列 测 定使 用 同 一 对 引 物。 测 序 结 果 在 ｈｔｔｐ：／／ｓａｕｒｅｕｓ． ｍｌｓｔ．ｎｅｔ网站进 行 序 列 比 对，确 定 其 ＳＴ 型 别 并 进 行亲缘关系比对。 １．２．３ 毒力因子检 测 每 株 菌 纯 培 养 物 采 用 细 菌 基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 提 取 ＤＮＡ，用 表 １ 所 列 毒 力因子基因特异引物进行 ＰＣＲ 检测。ＰＣＲ 产物 进 行琼脂糖凝胶电泳并成像。
ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ １９ ｍａｊｏｒ ｔｙｐｅｓ．ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ １６ ｔｙｐｅｓ，ｍａｉｎｌｙ ｔｙｐｅｓ Ｉ ａｎｄ Ｈ．ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｍａｉｎｌｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ
ｔｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｋ ａｎｄ Ｍ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ２０ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＦＧＥ ｔｙｐｅｓ，ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ＳＴ－２３９ ｔｙｐｅ．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （ＭＲＳＡ）ａｎｄ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ （ＭＳＳＡ）ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ（５３．９％ ｖｅｒｓｕｓ ４０．０％，χ２＝ ３２．７，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅａ，ｃｎａ ａｎｄ ｃａｐ８ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ （Ｐ＜０．０１），
ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ＳＴｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （８１２６０２４４）。 作 者 单 位 ：１．内 蒙 古 医 科 大 学 附 属 医 院 检 验 科 ，呼 和 浩 特
０１００５０；
源自文库
ｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ＳＴ－５，ＳＴ－７ ａｎｄ ＳＴ－１５．Ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 菌 株 及 质 控 菌 株 ２０１１ 年 １２ 月—２０１４ 年 ３月内蒙古呼和浩特地区 ６０例住院患 者（入 院 时 间 ＞４８ ｈ）分离 ＭＲＳＡ３０株和 ＭＳＳＡ３０ 株 作 为 研 究 对象。 其 中，２５ 株 分 离 自 伤 口 分 泌 物，１４ 株 分 离 自 全 血 标 本 ，１０ 株 分 离 自 脓 液 标 本 ，４ 株 分 离 自 咽 拭 子 标本，３株分离自痰 液 标 本，２ 株 分 离 自 尿 液 标 本，１ 株分离自胸 腹 水，１ 株 分 离 自 关 节 腔 积 液。 所 有 金 葡菌分离株均再次 鉴 定，并 依 据 美 国 临 床 与 实 验 室 标 准 化 协 会 （ＣＬＳＩ）２０１３ 年 版 标 准 进 行 药 敏 试 验 ，采 用头孢西丁纸 片 扩 散 法 确 认 ＭＲＳＡ 株。 质 控 菌 株 金 葡 菌 （ＡＴＣＣ２５９２３）由 本 实 验 室 保 存 。 １．１．２ 主 要 仪 器 和 试 剂 ＶＩＴＥＫ－Ⅱ 全 自 动 微 生 物分析系统及 配 套 革 兰 阳 性 菌 鉴 定 卡 ＧＰ （法 国 生 物梅里 埃 公 司）、２７２０ 型 ＰＣＲ 仪 （ＡＢＩ公 司）、脉 冲 场凝胶电泳设备（美国 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公 司）。头孢西丁药 敏 纸 片 购 自 英 国 ＯＸＯＩＤ 公 司。 溶 葡 萄 球 菌 素
２．中 国 疾 病 预 防 控 制 中 心 传 染 病 预 防 控 制 所 。 作 者 简 介 ：王 俊 瑞 （１９８１— ），男 ，博 士 ，主 治 医 师 ，主 要 从 事 金 黄 色
葡萄球菌感染致病机制研究。 通 信 作 者 ：韩 艳 秋 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｙｈ１０１６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
中国感染与化疗杂志２０１５年１月２０日第１５卷第１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｊａｎ．２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１
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ｂｕｔ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｃ，ｓｅｇ，ｓｅｉ，ｓｅｍ，ｓｅｎ，ｓｅｏ，ｆｎｂＢ，ｅｂｐＳａｎｄｃａｐ５ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ（Ｐ ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｏｈｈｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ．ＳＴ－２３９ ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ＰＦＧＥ ｔｙｐｅ ｏｆ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｓ ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｓｏ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｙ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｉｎ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ