欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性

欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性摘要：采用HPLC法测定欧李（Prunus humilis Bunge）种仁浓缩液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法测定苦杏仁苷的抗氧化性。

结果表明，提取液中苦杏仁苷的浓度为7.94 mg/mL；苦杏仁苷清除DPPH的能力随着其浓度的降低而下降，当苦杏仁苷溶液浓度为7.50 mg/mL时清除率最高，为90.9%。

欧李种仁浓缩液经氯仿、乙酸乙酯和加热处理均能提高水相中苦杏仁苷的纯度。

关键词：欧李（Prunus humilis Bunge）；种仁；苦杏仁苷；高效液相色谱；抗氧化性欧李（Prunus humilis Bunge）为蔷薇科樱桃属落叶小灌木，是我国特有的果实和药食兼用树种。

其茎叶、果实、根皮具有很高的经济和药用价值。

欧李种仁可以入药，具有利尿、助消化等功效，能治疗消化不良、水肿、肠胃停滞等疾病[1-3]。

欧李种仁中含有大量的苦杏仁苷，主要用于治疗慢性气管炎、急慢性呼吸道感染和脓疱病[4]，与其他药物合用还可治疗皮肤癌[5]；苦杏仁苷还具有抗凝血和抗氧化性的作用[6]。

苦杏仁苷具有明确的生理、药理活性。

关于苦杏仁苷分析检测的方法也比较完善，但国内对欧李苦杏仁苷分离提取工艺的深入研究还较少，所以本试验采用HPLC法测定欧李种仁浓缩液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法测定苦杏仁苷的抗氧化性，以期为欧李苦杏仁苷提取工艺的改进提供参考。

1 材料与方法1.1 材料试验于2012年6月在成都大学药食同源植物资源开发重点实验室进行。

欧李采自成都大学欧李种植基地。

将风干的欧李果实去果肉得到欧李种子，反复淘洗将果肉和种子分开，把得到的欧李种子放入烘箱中50 ℃干燥24 h。

干燥后人工去壳得到欧李种仁，将欧李种仁放入烘箱中50 ℃干燥48 h，备用。

1.2 仪器与试剂DIONEX-HPCL高效液相色谱仪；UV-1800紫外分光光度计。

苦杏仁苷标准品（纯度大于99.0%，中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、甲醇和石油醚（成都市科龙化工试剂厂）；DPPH（成都康普泰科技有限公司），以上试剂均为分析纯。

1.3 方法1.3.1 标准曲线的制作准确称取20 mg苦杏仁苷标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。

采用UV-1800紫外分光光度计多波长扫描检测苦杏仁苷标准品的最大吸收波长。

标准曲线的制作：精确称取20 mg苦杏仁苷标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。

准确量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于EP管中，分别加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL甲醇，配制成终浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的系列标准品溶液。

采用HPLC法测定不同浓度标准溶液，得到相应的峰面积。

以系列标准溶液的浓度（C）为横坐标，色谱峰面积（A）为纵坐标，制作苦杏仁苷标准曲线。

色谱条件：色谱柱C18柱；流动相，甲醇-水=30∶70；柱温28 ℃；检测波长220 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 欧李种仁中苦杏仁苷的提取及含量测定取100 g干燥种仁粉碎。

将粉碎后的欧李种仁粉末置于1 000 mL的烧瓶中，加入230 mL无水乙醇，恒温水浴（80～90 ℃）回流1 h，抽滤收集滤液，3次重复。

向合并滤液中加入少量蒸馏水，利用石油醚萃取去除滤液中的油脂，待分层后取下层液体。

利用旋转蒸发器将下层液体加热浓缩，得到苦杏仁苷浓缩液，利用蒸馏水定容至100 mL。

分别取1 mL上述溶液于2支EP管中，离心处理，取50 μL上清液稀释30倍，0.22 μm 微孔滤膜过滤，利用HPLC法检测苦杏仁苷的含量。

1.3.3 苦杏仁苷抗氧化性测定0.6 mmol/L DPPH溶液配制：精确称取0.039 g DPPH，用95%乙醇定容至50 mL，稀释10倍后得到0.6 mmol/L DPPH溶液备用。

反应体系：1 mL待测液加入2 mL 0.6 mmol/L DPPH和2 mL 95%乙醇，以不加样品为对照，混匀后于暗处反应30 min；另取5 mL 95%乙醇作调零对照；在517 nm处测定吸光值（A值）。

配制7.5 mg/mL的苦杏仁苷提取液，进行二倍稀释得到8个浓度梯度，分别为7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8、0.234 4、0.117 2、0.058 6、0.029 3 mg/mL。

将稀释后溶液作为抗氧化性测定的待测液，测定其吸光值（A）[7]。

1.3.4 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷取苦杏仁苷浓缩液5 mL分别置于2个分液漏斗中，分别加入等体积的氯仿和乙酸乙酯，充分振荡混匀，静置，待分层后，分别取有机相和水相利用“1.3.2”的方法测定苦杏仁苷的浓度。

1.3.5 加热对苦杏仁苷纯度的影响将苦杏仁苷浓缩液5 mL置于烧杯中，沸水浴中加热处理10 min，之后取样经离心后按照“1.3.2”的方法测定苦杏仁苷的浓度。

2 结果与分析2.1 苦杏仁苷最大吸收波长的确定如图1所示，采用UV-1800紫外分光光度计于200～400 nm波长下进行多波长扫描，得到苦杏仁苷标准品的最大吸收波长是220 nm，故在后续色谱检测苦杏仁苷含量时选择220 nm的检测波长。

2.2 苦杏仁苷标准曲线根据标准溶液测得的不同浓度标准品溶液色谱图（图2）进行分析，得到各个浓度标准溶液的数据，如表1所示。

根据表1中数据制作标准曲线，如图3所示。

以苦杏仁苷浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制得到苦杏仁苷标准曲线。

该回归曲线线性良好，相关系数R2=0.997 1，可以用于计算苦杏仁苷的浓度。

2.3 欧李种仁中苦杏仁苷的含量采用HPLC法进行检测，得到欧李种仁中苦杏仁苷的色谱图（图4），其峰面积为731.757 mAU·min。

根据标准曲线计算出溶液中苦杏仁苷浓度为7.94 mg/mL，即每100 g欧李种仁中苦杏仁苷含量为794 mg。

2.4 苦杏仁苷抗氧化性的测定研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化性，能够还原DPPH[8]。

由表2可知，苦杏仁苷清除DPPH的能力随着苦杏仁苷溶液浓度的降低而下降。

苦杏仁苷溶液浓度为7.50 mg/mL时，对DPPH的清除率最高，为90.9%；当苦杏仁苷溶液浓度为0.234 4 mg/mL时，清除率下降为5.4%。

2.5 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷分别采用氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷，结果表明，氯仿和乙酸乙酯均不能将混合液中的苦杏仁苷完全萃取出来；经检测，苦杏仁苷在氯仿相中的含量仅为0.17 mg/mL，在乙酸乙酯相中仅为0.21 mg/mL，低于萃取之后保留在水相中的苦杏仁苷的含量，表明氯仿和乙酸乙酯不能作为苦杏仁苷的萃取剂使用。

但是苦杏仁苷混合液经过两种有机溶剂萃取后，保留在水相中的苦杏仁苷的含量较萃取之前有了较为明显的提高。

这可能是混合液中的部分杂质被氯仿和乙酸乙酯分别萃取出去，从而提高了水相中苦杏仁苷的相对含量。

2.6 加热对苦杏仁苷纯度的影响利用沸水浴加热可以使醇溶性蛋白发生变性，从而提高苦杏仁苷的纯度。

水相提取液经沸水浴加热后，经HPLC法测定苦杏仁苷含量色谱图如图5所示。

溶液中苦杏仁苷浓度为12.1 mg/mL，相比较加热前有了大幅度提高。

说明通过加热处理可以除去苦杏仁苷溶液中的部分杂质，从而提高提取液中苦杏仁苷的纯度。

DPPH法检测加热处理后苦杏仁苷的抗氧化活性结果表明，苦杏仁苷的抗氧化性大幅度地降低（表3）；与检测不加热处理苦杏仁苷的抗氧化性比较发现，在浓度为7.5 mg/mL时，加热后其自由基清除率仅为69.8%；而浓度为 1.875 mg/mL时的清除率为0。

说明经过加热处理后，苦杏仁苷提取液的抗氧化活性有了明显的下降。

3 小结与讨论已有研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化作用[6]。

本试验研究结果表明，苦杏仁苷清除DPPH的能力随着苦杏仁苷溶液浓度的降低而下降。

苦杏仁苷溶液浓度为7.50 mg/mL时对DPPH的清除率最高，为90.9%。

本试验中提取苦杏仁苷的方法是采用无水乙醇在80～90 ℃下回流，因为试验所用材料为植物种子，所以在提取苦杏仁苷的过程中，一些醇溶性蛋白和黄酮类化合物也会被提取出来[9-11]。

采用氯仿和乙酸乙酯两种溶剂对苦杏仁苷的萃取结果表明，氯仿和乙酸乙酯不能作为苦杏仁苷的萃取剂使用。

但是经过两种溶剂萃取后，苦杏仁苷溶液中的部分杂质可以被两种溶剂除去，从而提高了水相中苦杏仁苷的相对含量。

苦杏仁苷混合液经过加热处理后，苦杏仁苷的相对含量大幅增加，说明加热处理可以去除苦杏仁苷溶液中的部分杂质，从而提高苦杏仁苷的纯度；然而苦杏仁苷的抗氧化活性却大幅下降。

经检测，加热后苦杏仁苷溶液浓度为7.5 mg/mL 时，自由基清除率仅为69.8%，这可能与加热去除了部分黄酮或其他抗氧化成分有关[12，13]。

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