欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性

欧李种仁中苦杏仁苷的提取及其抗氧化活性

摘要：采用HPLC法测定欧李（Prunus humilis Bunge）种仁浓缩液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法测定苦杏仁苷的抗氧化性。结果表明，提取液中苦杏仁苷的浓度为7.94 mg/mL；苦杏仁苷清除DPPH的能力随着其浓度的降低而下降，当苦杏仁苷溶液浓度为7.50 mg/mL时清除率最高，为90.9%。欧李种仁浓缩液经氯仿、乙酸乙酯和加热处理均能提高水相中苦杏仁苷的纯度。

关键词：欧李（Prunus humilis Bunge）；种仁；苦杏仁苷；高效液相色谱；抗氧化性

欧李（Prunus humilis Bunge）为蔷薇科樱桃属落叶小灌木，是我国特有的果实和药食兼用树种。其茎叶、果实、根皮具有很高的经济和药用价值。欧李种仁可以入药，具有利尿、助消化等功效，能治疗消化不良、水肿、肠胃停滞等疾病[1-3]。欧李种仁中含有大量的苦杏仁苷，主要用于治疗慢性气管炎、急慢性呼吸道感染和脓疱病[4]，与其他药物合用还可治疗皮肤癌[5]；苦杏仁苷还具有抗凝血和抗氧化性的作用[6]。

苦杏仁苷具有明确的生理、药理活性。关于苦杏仁苷分析检测的方法也比较完善，但国内对欧李苦杏仁苷分离提取工艺的深入研究还较少，所以本试验采用HPLC法测定欧李种仁浓缩液中苦杏仁苷的含量，利用DPPH法测定苦杏仁苷的抗氧化性，以期为欧李苦杏仁苷提取工艺的改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2012年6月在成都大学药食同源植物资源开发重点实验室进行。欧李采自成都大学欧李种植基地。

将风干的欧李果实去果肉得到欧李种子，反复淘洗将果肉和种子分开，把得到的欧李种子放入烘箱中50 ℃干燥24 h。干燥后人工去壳得到欧李种仁，将欧李种仁放入烘箱中50 ℃干燥48 h，备用。

1.2 仪器与试剂

DIONEX-HPCL高效液相色谱仪；UV-1800紫外分光光度计。

苦杏仁苷标准品（纯度大于99.0%，中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、甲醇和石油醚（成都市科龙化工试剂厂）；DPPH（成都康普泰科技有限公司），以上试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作准确称取20 mg苦杏仁苷标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。采用UV-1800紫外分光光度计多波长扫描检测苦杏仁苷标准品的最大吸收波长。

标准曲线的制作：精确称取20 mg苦杏仁苷标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。准确量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于EP管中，分别加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL甲醇，配制成终浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的系列标准品溶液。采用HPLC法测定不同浓度标准溶液，得到相应的峰面积。以系列标准溶液的浓度（C）为横坐标，色谱峰面积（A）为纵坐标，制作苦杏仁苷标准曲线。

色谱条件：色谱柱C18柱；流动相，甲醇-水=30∶70；柱温28 ℃；检测波长220 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 欧李种仁中苦杏仁苷的提取及含量测定取100 g干燥种仁粉碎。将粉碎后的欧李种仁粉末置于1 000 mL的烧瓶中，加入230 mL无水乙醇，恒温水浴（80～90 ℃）回流1 h，抽滤收集滤液，3次重复。向合并滤液中加入少量蒸馏水，利用石油醚萃取去除滤液中的油脂，待分层后取下层液体。利用旋转蒸发器将下层液体加热浓缩，得到苦杏仁苷浓缩液，利用蒸馏水定容至100 mL。分别取1 mL上述溶液于2支EP管中，离心处理，取50 μL上清液稀释30倍，0.22 μm 微孔滤膜过滤，利用HPLC法检测苦杏仁苷的含量。

1.3.3 苦杏仁苷抗氧化性测定0.6 mmol/L DPPH溶液配制：精确称取0.039 g DPPH，用95%乙醇定容至50 mL，稀释10倍后得到0.6 mmol/L DPPH溶液备用。

反应体系：1 mL待测液加入2 mL 0.6 mmol/L DPPH和2 mL 95%乙醇，以不加样品为对照，混匀后于暗处反应30 min；另取5 mL 95%乙醇作调零对照；在517 nm处测定吸光值（A值）。配制7.5 mg/mL的苦杏仁苷提取液，进行二倍稀释得到8个浓度梯度，分别为7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8、0.234 4、0.117 2、0.058 6、0.029 3 mg/mL。将稀释后溶液作为抗氧化性测定的待测液，测定其吸光值（A）[7]。

1.3.4 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷取苦杏仁苷浓缩液5 mL分别置于2个分液漏斗中，分别加入等体积的氯仿和乙酸乙酯，充分振荡混匀，静置，待分层后，分别取有机相和水相利用“1.3.2”的方法测定苦杏仁苷的浓度。

1.3.5 加热对苦杏仁苷纯度的影响将苦杏仁苷浓缩液5 mL置于烧杯中，沸水浴中加热处理10 min，之后取样经离心后按照“1.3.2”的方法测定苦杏仁苷的浓度。

2 结果与分析

2.1 苦杏仁苷最大吸收波长的确定

如图1所示，采用UV-1800紫外分光光度计于200～400 nm波长下进行多波长扫描，得到苦杏仁苷标准品的最大吸收波长是220 nm，故在后续色谱检测苦杏仁苷含量时选择220 nm的检测波长。

2.2 苦杏仁苷标准曲线

根据标准溶液测得的不同浓度标准品溶液色谱图（图2）进行分析，得到各个浓度标准溶液的数据，如表1所示。根据表1中数据制作标准曲线，如图3所示。以苦杏仁苷浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制得到苦杏仁苷标准曲线。该回归曲线线性良好，相关系数R2=0.997 1，可以用于计算苦杏仁苷的浓度。2.3 欧李种仁中苦杏仁苷的含量

采用HPLC法进行检测，得到欧李种仁中苦杏仁苷的色谱图（图4），其峰面积为731.757 mAU·min。根据标准曲线计算出溶液中苦杏仁苷浓度为7.94 mg/mL，即每100 g欧李种仁中苦杏仁苷含量为794 mg。

2.4 苦杏仁苷抗氧化性的测定

研究表明，苦杏仁苷具有一定的抗氧化性，能够还原DPPH[8]。由表2可知，苦杏仁苷清除DPPH的能力随着苦杏仁苷溶液浓度的降低而下降。苦杏仁苷溶液浓度为7.50 mg/mL时，对DPPH的清除率最高，为90.9%；当苦杏仁苷溶液浓度为0.234 4 mg/mL时，清除率下降为5.4%。

2.5 氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷

分别采用氯仿和乙酸乙酯萃取苦杏仁苷，结果表明，氯仿和乙酸乙酯均不能将混合液中的苦杏仁苷完全萃取出来；经检测，苦杏仁苷在氯仿相中的含量仅为0.17 mg/mL，在乙酸乙酯相中仅为0.21 mg/mL，低于萃取之后保留在水相中的苦杏仁苷的含量，表明氯仿和乙酸乙酯不能作为苦杏仁苷的萃取剂使用。但是苦杏仁苷混合液经过两种有机溶剂萃取后，保留在水相中的苦杏仁苷的含量较萃取之前有了较为明显的提高。这可能是混合液中的部分杂质被氯仿和乙酸乙酯分别萃取出去，从而提高了水相中苦杏仁苷的相对含量。

2.6 加热对苦杏仁苷纯度的影响

利用沸水浴加热可以使醇溶性蛋白发生变性，从而提高苦杏仁苷的纯度。水相提取液经沸水浴加热后，经HPLC法测定苦杏仁苷含量色谱图如图5所示。溶液中苦杏仁苷浓度为12.1 mg/mL，相比较加热前有了大幅度提高。说明通过加热处理可以除去苦杏仁苷溶液中的部分杂质，从而提高提取液中苦杏仁苷的纯度。

DPPH法检测加热处理后苦杏仁苷的抗氧化活性结果表明，苦杏仁苷的抗氧