第二章___培养基及其制备
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第二章 病毒的培养
五、细胞培养 （一）细胞培养的条件要求 1、细胞密度 原代细胞：4~6×105个/ml 传代细胞：2~3×105个/ml 2、pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3、培养温度
（二）细胞培养的方法 1、单层细胞培养 2、悬浮细胞培养 3、微载体细胞培养
（三）原代细胞培养 基本步骤：
1、血清（serum） 1）血清的种类和来源
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum)
７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml） 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总
数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K
（稀释倍数）。
○表示可计数 ●表示不计数
血细胞计数板
体外细胞的染色检测方法： 原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两 种细胞。 常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）
2、长途运送细胞培养物的保存。 取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养
液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留 空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的 包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右， 到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。
（六）细胞培养物的冻存与复苏 1、培养物的冻存与复苏原理
冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在 加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件）， 并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的温速率将冻存的培养物恢 复到常温的过程。
第二章 双碟制备.
目前已使用的各种培养基都是前人经过反 复实践，比较设计的成果。
自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等 为氮素营养
异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮 有机物为氮源
矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需 要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元 素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中 常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、 NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因 子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，
培养基Ⅱ号 胨 牛肉浸出粉 酵母粉 葡萄糖 琼脂 蒸馏水
6g 1.5g
6g 1g 15~20g 1000ml
中国药典2005年版二部附录的抗生素微生 物检定法中收载了13种不同处方的培养基
及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，
使用方便。临用时按照使用说明进行配制， 但应注意核对培养基的PH，必要时需调节 PH，使其符合规定。另外，市售干燥培养
基的质量也存在差异，注意选择合适的产 品。
第二章 双碟的制备
配好的培养基，根据需要趁热分装至试管 或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘
在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的 1/3～1/2；装试管一般为试管高度的1/5～ 1/4，先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞 既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、 大小应适当，以免使用时影响操作(如图)。 最后用牛皮纸或报纸包住棉塞，扎紧在瓶 颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉 塞或脱落。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用 麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称 琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。 市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多
聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分 解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃， 凝固点42℃，1.5～2％的水溶液在一般培养温度 下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生 物的分离培养、菌种鉴定和保藏。
自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等 为氮素营养
异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮 有机物为氮源
矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需 要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元 素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中 常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、 NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因 子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，
培养基Ⅱ号 胨 牛肉浸出粉 酵母粉 葡萄糖 琼脂 蒸馏水
6g 1.5g
6g 1g 15~20g 1000ml
中国药典2005年版二部附录的抗生素微生 物检定法中收载了13种不同处方的培养基
及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，
使用方便。临用时按照使用说明进行配制， 但应注意核对培养基的PH，必要时需调节 PH，使其符合规定。另外，市售干燥培养
基的质量也存在差异，注意选择合适的产 品。
第二章 双碟的制备
配好的培养基，根据需要趁热分装至试管 或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘
在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的 1/3～1/2；装试管一般为试管高度的1/5～ 1/4，先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞 既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、 大小应适当，以免使用时影响操作(如图)。 最后用牛皮纸或报纸包住棉塞，扎紧在瓶 颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉 塞或脱落。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用 麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称 琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。 市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多
聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分 解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃， 凝固点42℃，1.5～2％的水溶液在一般培养温度 下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生 物的分离培养、菌种鉴定和保藏。
植物组织培养复习笔记【最新】
植物组织培养复习资料第一章绪论一、概念：植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官.组织，细胞以及原生质体. 培养在人1:培养基上和人工控制的环境中，使其生长，分化，增殖，甚至长出新的植株的过程和技术。
外植体：在无菌条件下，离体培养于人工培养基上的，用于达到某种培养目的的原始植物材料C培养基：根据植物营养原理和植物组织离体培养的要求而人匚配制的营养基质即为培养基。
细胞全能性：植物体每一个细胞都含有该植物全部的遗传信息，在合适的条件下，具有形成完整植株的能力。
脱分化：一个成熟细胞恢复到分生状态或胚性细胞状态的现象。
再分化：是脱分化细胞重新恢复细胞分化能力，沿若正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞C二、组织培养的类型，不同分类依据（根据培养材料不同）可分为植株培养，胚胎培养，器官培养，组织或愈伤组织培养.细胞或原生质休培养5类：（根据培养目的）可分为试管嫁接，试管受精，试管加倍，试管育种等：（根据培养方法）可分为平板培养，微室培养，悬浮培养，单细胞培养等：（根据培养过程）可分为初代培养和继代培养：（根据培养基类型）可分为固体培养和液体培养。
三、三个发展阶段的关键人物1,haberlandt-一于1902年提出植物细胞全能性理论，被称为“组织培养之父”。
2,white—于1943年出版《植物组织培养手册》。
3,murashine和skoog -- 在1962年筛选出MS培养基。
四、植物全能性表达的过程培养一►脱分彳~再分化一培养五、组织培养的特点：1、植物基础学科研究的良好系统。
2、生物技术的基础。
3、经济高效.管理方便，利于自动化。
4、技术含量高，实验误差小，人工控制能力强。
5、生长周期短，生长速度快，实验重复性好。
6、实验材料经济，来源单一。
六、缺点：需要设备负复柴，投入资金多，电能消耗大：对人员技术水平要求高，对实验场所要求也高，不能代替田间试验。
第二章植物组织培养设备与培养条件一、实验室的组成及主要仪器和设备准备室：干燥箱，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，水浴锅，冰箱。
第二章 培养基
H H H N S O O N
CH3 CH 3 COOH
14
• 青霉素合成中用玉米浆，因玉米浆中含有 苯乙胺，其被优先结合到青霉素分子中， 提高了青霉素G的产量。 • 另有半胱氨酸及缬氨酸
H H H N S O O N
CH3 CH 3 COOH
15
第二节
培养基的配制原则
一.营养物质应满足微生物的需要 不同营养类型的微生物对营养的需求差 异很大，所以，应根据所培养菌种对各营 养要素的不同要求进行配制。如自养微生 物的培养基成分是无机的，而异养型微生 物的培养基成分必须含有机物。 针对四大类微生物，一般可以采用现成 配方的培养基。如细菌采用肉汤蛋白胨培 养基、放线菌采用高氏1号合成培养基、酵 母采用麦芽汁培养基及霉菌采用查氏合成 培养基。
第二章 培养基
1
第一节 培养基的成分及来源
• 1．定义：培养基是人工配制的供微生物或 动植物细胞生长，繁殖，代谢和合成人们 所需产物的营养物质和原料，同时，培养 基也为微生物等提供除营养外的其它生长 所必须的环境条件。 • 2．培养基要求 （1）都必须含有作为合成细胞组成的原料 （2）满足一般生化反应的基本条件，如C、 N源，无机盐、生长因素
9
（2）无机氮源
• • • • • 1）种类：铵盐、硝酸盐和氨水等。 无机氮源比有机氮源吸收利用快 无机氮源称为迅速利用N源 有机氮源称为缓慢利用N源 生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）的能 形成酸性物质无机氮源称为生理酸性物质
• 生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）的能 形成碱性生物的无机氮源称为生理碱性物质
16
二.营养物的浓度及配比应恰当 营养物的浓度太低，则不能满足 微生物生长的需要，浓度太高，又会 抑制微生物的生长。如糖和盐都是良 好的营养物质，但是，浓度升高，则 有抑菌作用。
植物组织培养的培养条件
肌醇
100mg/L
KI
0.83 mg/L
H3BO3
6.2 mg/L
MnSO4.4H2O 22.3 mg/L
ZnSO4.7H20 8.6 mg/L
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L
CuSO4.5H2O 0.025 mg/L
CoCl2.6H2O 0.025 mg/L
Na2.EDTA
37.3 g/L
FeSO4.7H2O 27.8 mg/L
• 铁盐的配法:
Fe2+在培养基中不稳定，故要用螯合剂 Na2－EDTA来配制配制方法如下：
在装有400 ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛 性钠，溶解后加入3.73g Na2 –EDTA, 加 热使其全部溶解，然后边搅拌，边慢慢 加入2.78g FeSO4·7H2O直至全部溶解,冷 却后定容至1000 ml（浓度10 ml/L)，倒入 棕色试剂瓶中，置于冰箱中冷藏，保存 备用
１L培养基中用量 称取量（g） 定容体积 (mg)
1900
19
分别溶解
1650
16.5
后混合定 容至1000
370
3.70 ml。
170
1.70
440
4.40
• 注意：为避免发生沉淀，应注意各种化合物的组合以 及加入的先后顺序。
• 母液的浓度可用a ml/L表示，其意义为：配制1升培养 基吸取该母液a毫升。
✓水解酪蛋白：浓度100－200mg/L，应用在微茎尖培 养
Auxins——生长素
溶于95%乙醇或 1mol/LNaOH
诱导细胞的分裂和根的分化
培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响
No NAA
NAA reduced to 0.1 mg. l-1
组织培养 植物组织培养基本操作
2020/3/24
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
2020/3/24
大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
2020/3/24
⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
2020/3/24
4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
2020/3/24
5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
2020/3/24
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
2020/3/24
大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
2020/3/24
⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
2020/3/24
4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
2020/3/24
5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
2020/3/24
培养基及其制备(英文版)
Starch found in grains, potatoes, beans, peas, cassava
Typically 20-30% amylose, remainder amylopectin
Characteristics of starch
➢Insoluble in hot water ➢Blue complex compound by reaction with iodine. ➢Insoluble in 30% of ethanol solution or above. ➢Hydrolyzed by acid and enzyme, the ultimate product is glucose.
Different medium for different food products
Chinese distilled spirit：solid medium Fruit spirit：fruit juice or fruit sauce Beer：wort Alcohol : starch mash Amino acid: starch mash Citric acid：starch mash Lactic acid：starch mash
and growth extract, corn steep liquor,
factors
wheat germ meal
1. Carbon sources
(1) Starch (corn, wheat, potato )
➢Widely used in fermentation industry ➢Starch dextrin glucose ➢Advantages: cheaper than glucose
《植物生物技术》教学大纲
《植物生物技术》教学大纲一、课堂教学大纲1、教学目的该课程系统地论述了植物生物技术的理论和方法，既介绍了基本知识，也反映了该领域的最新研究进展。
全课程共分三大部分：植物组织培养、植物基因工程和植物分子标记及应用。
要求学生全面系统地了解植物生物技术的发展过程和发展趋势；理解各部分的基本理论、原理和概念；融会贯通三大部分的内容，并能运用所学技术解决生产中的实际问题。
通过学习，使学生学习掌握现代生物技术知识的技能和方法，尤其要求学生具有将植物生物技术与传统方法相结合改良植物、培育新品种、设计高新技术产业的能力，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。
2、教学内容第一章绪论（2学时）•生物技术的产生与发展•植物生物技术与农业革命•植物生物技术在未来农业生产中所起的作用第二章植物细胞培养实验室建设与操作技术（2学时）本章重点、难点：植物组织培养所涉及的基本概念；培养基的组成、特点和用途；植物组织培养实验室建设；无菌操作的原理与技术等。
•植物组织培养实验室建设•实验室的设置•主要仪器设备、用途和使用方法•无菌操作器械•培养基及其制备•培养基的成分组成•常用培养基及其特点•培养基的改良与效应分析•培养基的制备•植物组织培养离体操作技术•培养用品的清洗与洗涤液的使用•灭菌与消毒•无菌操作技术•无菌操作中应注意的事项第三章胚胎培养（2学时）本章重点、难点：胚培养、胚珠培养和胚乳培养的意义，在育种工作中的实用价值。
•胚培养•胚培养的意义和用途•胚培养的方法•影响胚培养效果的因素•培养条件下的胚发育•胚珠培养•胚珠培养的意义•胚珠培养操作技术•胚乳培养•胚乳培养的意义•影响胚乳培养效果的因素•植株再生•离体授精第四章植物愈伤组织的诱导与分化培养（2学时）本章重点、难点：愈伤组织诱导、继代、培养与分化的基本术语和概念；器官发生；体细胞胚胎发生与植株再生；促进细胞分化的方法手段。
•愈伤组织的诱导与继代培养•脱分化、再分化的概念•愈伤组织的诱导、时期划分，各时期愈伤组织的特征特性•继代培养及继代培养的意义•悬浮培养及其用途•愈伤组织分化与植株再生•器官发生与植株再生•体细胞胚胎发生与植株再生•体细胞胚胎发生过程•体细胞胚的概念与内涵•体细胞胚胎发生与器官发生的区别•影响体细胞胚胎发生的外部因素•影响体细胞胚胎发生的外部因素•影响体细胞胚胎发生的内在因素•试管苗的移栽与护理•试管苗与自然苗的生理区别•试管苗移栽时应注意的事项第五章体细胞无性系变异与植物改良（2学时）本章重点、难点：体细胞克隆变异产生的遗传基础；体细胞克隆变异的育种应用。
第二章 培养基1
• 水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分 为氨基酸，使用浓度为100-200mg／L。受 酸和酶的作用易分解，使用时要注意。
• 其他 酵母提取液(YE)(0．01％-0．05％)， 主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取 液(0．01％~0.5％)、苹果和番茄的果汁、 黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较 稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。
4．2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)
优点：诱导能力要比IAA高10-20倍，特别在促进愈伤组 织的形成上活力最强。 缺点：但它会强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。因 而其适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。 适用：一般用于细胞启动脱分化阶段，而诱导分化阶段 往往不用2,4-D，而用NAA 或IAA 、IBA等。 脱分化---是指使已分化了的停止分裂的细胞失去分化特 性，回复到未分化的幼龄状态，恢复细胞分裂的 能力的过程。 分化---是指使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组 织，再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构 的特化细胞。
五、糖类
糖在组培中是不可缺少的 1.作用： 一是作为离体组织赖以生长的碳源 二是使培养基维持一定的渗透压（一般在1.5-
4.1MPa）。
2.种类：蔗糖（多用），其浓度为1%-5%,也可 用砂糖、葡萄糖或果糖等。
• 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对 水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最 好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不 同植物不同组织的糖类需要量也不同，实 验时要根据配方规定按量称取，不能任意 取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制 定配方时要给予考虑。在大规模生产时， 可用食用的绵白糖代替。
1．吲哚乙酸（IAA）:是从植物中提取出来的，它 在高等植物中普遍存在，在幼嫩的生长旺盛的部 位含量更高。 优点：对器官形成的副作用较小 缺点：易受体内酶的分解，受光易氧化，在高温 高压的灭菌中热稳定性较差，并且其药剂 的活性也较低，可能是最弱的激素。 而人工合成的生长素则不会受到酶的分解，高温 高压下表现也比较稳定。所以在组织培养中通常 使用人工合成的类似物，如IBA 、NAA和2,4-D。
植物组织培养培养基及其配制
微量元素指小于0.5mmol/L的元素，Fe,B,Mn,-Zn、Cu,Mo,-Co等-铁是一些氧化酶、细胞 素氧化酶、过氧化氢酶-等的组成成分；是叶绿素形成的必要条件。对胚-的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用-供 物：鳌合铁FeSO4·7H,0+Na2一EDTA在-制做培养基时不用Fe2SO43,-和FeCl,因其在H值5.2以上，易形成FeOH田3的不溶性沉淀-B,Mn,Zn,Cu,Mo,Co等：也是植物组织培-养中不 缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、-发育异常现象
3K-作用：对碳水化合物合成、-转移、以及氮素代-谢等有密切关系。一般为1一3mg-/L为好-供应物质：K I、KNO,等盐类提供-4Mg、S和Ca-Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；-S-是含S氨基酸和蛋 质的组成成分。-Ca-是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂-保护质膜不受破坏有显著作用
二、培养基的成分-水、无机盐、有机物、天然复合物、-植物激素、培养体的支持材料、抗生素、-活性炭等。
一水-是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过-程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺-少的物质-配制培 基母液时要用蒸馏水，以保持母液及-培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质-大规模生产时可用自来水。但在少 研究上尽-量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
肌醇yo-inosltol又叫环己六醇-作用：-能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽-的形成-对组织和细胞的 殖、分化有促进作用。-对细胞壁的形成也有作用。-使用浓度：一般为1OOmg/L,
氨基酸almino acide是很好的有机氮源-可直接被细胞吸收利用-常用的氨基酸：甘氨酸，-其他的如精氨 、谷-氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸-等也常用-水解乳蛋白或水解酪蛋白：它们是牛乳用酶法-等加工 水解产物，是含有约20种氨基酸的混-合物，用量在10-1000mg/L之间。由于它们-营养丰富，极易引起污 。如在培养中无特别-需要，以不用为宜
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第二章
培养基及其制备
本章内容简介：
• 培养基及灭菌
• 淀粉水解糖的制备
• 糖蜜前处理
• 纤维素代粮发酵
第一节 培养基的原材料
微生物细胞的化学组成
一、水（water） 二、干物质（dry material）
元素 C H O N 微生物 细菌 酵母菌 霉菌 蛋白质 50~80 32~75 14~15 细菌 50 8 20 15 糖类 12~18 27~63 7~40 酵母菌 49.8 6.7 31.1 12.4 脂类 5~20 2~15 4~40 核酸 10~20 6~8 1 霉菌 47.9 6.7 40.2 5.2 灰分物质 2~30 3.8~7 6~12
1、碳 源
一切能满足微生物生长繁殖所需 要C元素的营养物称为碳源。
碳源谱
｛
有机碳 无机碳
异养微生物
自养微生物
●实验室配制微生物培养基常用碳源
葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉
●工业生产常用的碳源
淀粉或其水解糖、糖蜜、纤维素、 麸皮、米糠等
对于为数众多的化能异养微生物来说， 碳源是兼有能源功能营养物。
2、氮 源
淀粉生产举例
• 玉米淀粉
• 小麦淀粉
• 大ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ • 薯类
– 蛋白质含量低、多酚类物质易褐变 – 发芽含毒素 – 贮存困难
直链淀粉结构
CH20H 0H
0 0
CH20H 0H
0 0 0H n
CH20H 0H
0 0H 0H
0H
0H
直链淀粉是由不分支的葡萄糖所构成,葡萄糖分子间以 α-1,4-糖苷键聚合而成,呈链状结构,聚合度约100～ 600之间,它的水悬浮液加热时,不产生糊精,而以胶体 状态溶解,遇碘反应是纯蓝色。
凡提供微生物生长繁殖所需要氮元素 的营养源，称为氮源。
有机氮 氮源谱
蛋白质 核酸 氨基酸 尿素 NH3 NH4+ NO3-
无机氮 分子态氮
N2
●实验室配制微生物培养基常用氮源
蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、尿 素、铵盐、硝酸盐。
●工业生产常用的氮源
尿素、玉米浆、鱼粉、蚕蛹、黄 豆饼、花生饼等。
3、氧
①添加青霉素法 ②添加表面活性剂 ③添加抗氧剂法
2.追加糖蜜法 原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可 在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。 3.采用营养缺陷变异株 原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，是生物素 不再影响谷氨酸的积累
第四节 纤维素代粮发酵
石油代粮发酵原料
石油代粮发酵： 微生物利用石油化工产品，得到蛋白，氨基酸， 抗生素，酶，柠檬酸，维生素等产品。 石油代粮发酵的特点： 不耗粮食； 反应不需高温高压耐腐蚀的设备； 耗氧产热，因此要求菌种耐高温； 需保证产物安全无毒；
随着原料的转换，不仅要选育与原料转换 相适应的菌种，同时发酵的控制方法也不相同。
第二节 淀粉水解糖的制备
• 关于淀粉的那些事儿？
– 淀粉的存在形式、含量、化学结构 – 淀粉的分离方法
• 淀粉制糖的工艺技术概况
– 酸法、酸酶法、酶酸法、双酶法
• 典型制糖工艺中酶的问题
– 液化酶 – 糖化酶
• 工艺操作注意事项
双酶法
98 99 0.1 0.1 98 99 温和/少 少 长 大/一般 各种淀粉原料 有利
酸酶法
95 93 0.4 0.08 90 95 加压温高/多 中 中 中/中 大米 中
酸解法
90 86 1.6 0.08 80 90 加压温高/多 多 短 小/较高 各种淀粉原 料 差
双酶水解法制葡萄糖的优点 ：
微生物细胞中的物质组成
有机物：蛋白质、糖、脂、核酸、维生素。
灰分 水——细胞干重的70%~90%。
水是微生物及一切生物细胞中含量最多的成分。 微生物细胞的含水量随种类和生长期而异。通常 情况下，细菌含水量为细胞鲜重的75%～85%， 酵母菌为70%～85%，丝状真菌为85%～90%， 细菌芽孢和霉菌孢子的含水量约为40%。
石油代粮发酵的原料：
• 各种石油馏分：正烷烃，轻油，灯油等 • 各种石化产品：甲醇，乙醇，醋酸（for 谷氨酸、赖氨酸），乙二醇，丙二醇等
• 石油酵母菌体：为维生素B2和酶的生产提 供C、N源（间接石油发酵）
几乎所有糖发酵产物都可通过石油馏分发酵 获得
能源危机 CO2温室 效应 首选 纤 维 素
淀粉水解糖的制备方法
淀粉水解的方法
☆酸解法 ：无机酸，高温高压。副产物较多，转化率低。 ☆酶酸法 ：酸解为糊精或低聚糖，再酶解为葡萄糖。
☆酸酶法 ：α-淀粉酶液化，再用酸水解为葡萄糖。
☆双酶法
淀粉糖化方法比较
糖液质量
葡萄糖值（DE） 葡萄糖含量（%干基） 灰分（%） 蛋白（%） 颜色（透光率%） 淀粉对糖转化率（%） 工艺条件/耗能 副产物 生产周期 设备规模/防腐要求 原料适应情况 是否有利于发酵提取
不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜前处理的一般方法
1.加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法） 通风，沉淀，提高N、O2含量 2.加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法） 效果比方法1好，但是费时费设备，不适于大规模生产 3.添加絮凝剂澄清处理法 澄清效果较好 目的：通过稀释，酸化，灭菌，澄清，使之更适于发酵
谷氨酸发酵的糖蜜前处理
一、微生物的营养物质
营养物质按照它们在机体中的生理作 用不同，可以将它们区分成六大类。 1、碳源(Source of carbon) 2、氮源(Source of Nitrogen) 3、氧气(Oxygen) 4、水 (Water) 5、无机盐(Inorganic salt) 6、生长因子(Growth factor)
过滤→ 低糖 →阳离子交换柱→阴离子交换柱→三效 浓缩蒸发→高糖
双酶法制糖工艺
◆葡萄糖的理论收率
(C6H10O5)n+nH2O →nC6H12O6
162 18 180
理论收率是111.11%
◆葡萄糖的实际收率 实际收率 = 投入淀粉量(m) × 淀粉含量(ωc’) 糖液体积(V) × 糖液葡萄糖含量(ωc) ×100%
（C6H10O5）n ---→（C6H10O5）n---→ C12H22O11---→C6H12O6 淀粉 各种糊精 麦芽糖 葡萄糖 （1）理论转化率：葡萄糖/淀粉=180/162=111% （2）葡萄糖纯度DE=还原糖/干物质(%)
葡萄糖聚合度与碘液的呈色表
葡萄糖聚合度 7~8 16 21 28 34 41 61 120 330 与碘液呈色 无色 淡红色 红色 红紫色 紫色 兰紫色 兰色 兰色 兰色 最高吸收波长（nm)
可再生 生物质 CO零排放 不能作为食物 来源广泛
• 化石能源的不可再生性 • 温室气体 • 生物质资源的利用同时具有可再生和CO 零 排放的双重特征，完全符合可持续发展的 要求。纤维素是一种重要的生物质 • 资源，它不能作为人类食物，且来源极为 广泛，例如农作物的秸秆等。因而以纤维 素为原料制备能源化学品，是发展生物质 能源转化的首选方案。
待处理物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 处理目的：澄清→脱钙→脱除生物素
糖蜜预处理方法
①活性炭处理法 稀释，漂白粉，活性炭，过滤 ②树脂处理法 ③亚硝酸处理法 原理：破坏生物素
原理：吸附
还可以采用以下三种方法脱除生物素：
1.添加化学药剂处理法 原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性
矿质元素的生理功能
6、生长因子
通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小， 但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生 长需要的有机化合物。 狭义：维生素 广义：维生素、氨基酸、嘌呤及嘧啶
二、培养基的类型 1.依营养物质的来源分类
①天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） ②合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等 ） ③半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖
淀粉的深加工
第三节
糖蜜前处理
一、糖蜜的来源与特点
二、糖蜜前处理的方法
三、谷氨酸发酵糖蜜前处理
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产 物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。 糖蜜除含糖份外，还含有较多的杂质，其中有些是有 用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预 处理。
配制培养基的一般原则 1. 选用合适的营养物质 2. 确定各营养物的适当配比 3. 基质环境的调节 4. 营养原料的经济性
四、原料转换及意义
发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、 油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、 淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、 油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发 酵产品品种和产量与日俱增，每年都消耗大量粮 食、油料和蛋白质原料。
培养基）
2.依培养基制成的形式分：
①液体培养基； ②固体培养基；
3.依培养基主要成分和使用目的来分
①基础培养基 ②完全培养基 ③鉴别培养基 ④选择培养基
4.根据生产工艺来分
①孢子培养基 ②种子培养基 ③发酵培养基
附：培养基配方举例
三、发酵培养基的选择
发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实 验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；
支链淀粉结构
CH20H 0 0 0H CH2 0H 0 0 0H CH2 0H 0
0H
0H
0H
0H n
0H
0
CH2 0H 0 0H
0 0 0H
CH2 0H
0 0 0H
CH2 0H 0 0H 0H
支链淀粉(胶淀粉)其直链由葡萄糖分子以α-1,4-糖苷 键相连结,而支链与直链葡萄糖分子以α-1,6-糖苷键 相连结,分子呈树状,它是一种膨胀性的物质,置于水中 加热时成为胶粘的糊状物,而且只有在加热加压的条件 下,才能溶解于水,遇碘呈紫红色反应。
培养基及其制备
本章内容简介：
• 培养基及灭菌
• 淀粉水解糖的制备
• 糖蜜前处理
• 纤维素代粮发酵
第一节 培养基的原材料
微生物细胞的化学组成
一、水（water） 二、干物质（dry material）
元素 C H O N 微生物 细菌 酵母菌 霉菌 蛋白质 50~80 32~75 14~15 细菌 50 8 20 15 糖类 12~18 27~63 7~40 酵母菌 49.8 6.7 31.1 12.4 脂类 5~20 2~15 4~40 核酸 10~20 6~8 1 霉菌 47.9 6.7 40.2 5.2 灰分物质 2~30 3.8~7 6~12
1、碳 源
一切能满足微生物生长繁殖所需 要C元素的营养物称为碳源。
碳源谱
｛
有机碳 无机碳
异养微生物
自养微生物
●实验室配制微生物培养基常用碳源
葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉
●工业生产常用的碳源
淀粉或其水解糖、糖蜜、纤维素、 麸皮、米糠等
对于为数众多的化能异养微生物来说， 碳源是兼有能源功能营养物。
2、氮 源
淀粉生产举例
• 玉米淀粉
• 小麦淀粉
• 大ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ • 薯类
– 蛋白质含量低、多酚类物质易褐变 – 发芽含毒素 – 贮存困难
直链淀粉结构
CH20H 0H
0 0
CH20H 0H
0 0 0H n
CH20H 0H
0 0H 0H
0H
0H
直链淀粉是由不分支的葡萄糖所构成,葡萄糖分子间以 α-1,4-糖苷键聚合而成,呈链状结构,聚合度约100～ 600之间,它的水悬浮液加热时,不产生糊精,而以胶体 状态溶解,遇碘反应是纯蓝色。
凡提供微生物生长繁殖所需要氮元素 的营养源，称为氮源。
有机氮 氮源谱
蛋白质 核酸 氨基酸 尿素 NH3 NH4+ NO3-
无机氮 分子态氮
N2
●实验室配制微生物培养基常用氮源
蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、尿 素、铵盐、硝酸盐。
●工业生产常用的氮源
尿素、玉米浆、鱼粉、蚕蛹、黄 豆饼、花生饼等。
3、氧
①添加青霉素法 ②添加表面活性剂 ③添加抗氧剂法
2.追加糖蜜法 原理：当谷氨酸酶系统成熟时过量生物素不影响发酵，可 在此时添加未处理的糖蜜进去继续正常生产。 3.采用营养缺陷变异株 原理：诱变生物素缺陷型菌株为油酸缺陷型等，是生物素 不再影响谷氨酸的积累
第四节 纤维素代粮发酵
石油代粮发酵原料
石油代粮发酵： 微生物利用石油化工产品，得到蛋白，氨基酸， 抗生素，酶，柠檬酸，维生素等产品。 石油代粮发酵的特点： 不耗粮食； 反应不需高温高压耐腐蚀的设备； 耗氧产热，因此要求菌种耐高温； 需保证产物安全无毒；
随着原料的转换，不仅要选育与原料转换 相适应的菌种，同时发酵的控制方法也不相同。
第二节 淀粉水解糖的制备
• 关于淀粉的那些事儿？
– 淀粉的存在形式、含量、化学结构 – 淀粉的分离方法
• 淀粉制糖的工艺技术概况
– 酸法、酸酶法、酶酸法、双酶法
• 典型制糖工艺中酶的问题
– 液化酶 – 糖化酶
• 工艺操作注意事项
双酶法
98 99 0.1 0.1 98 99 温和/少 少 长 大/一般 各种淀粉原料 有利
酸酶法
95 93 0.4 0.08 90 95 加压温高/多 中 中 中/中 大米 中
酸解法
90 86 1.6 0.08 80 90 加压温高/多 多 短 小/较高 各种淀粉原 料 差
双酶水解法制葡萄糖的优点 ：
微生物细胞中的物质组成
有机物：蛋白质、糖、脂、核酸、维生素。
灰分 水——细胞干重的70%~90%。
水是微生物及一切生物细胞中含量最多的成分。 微生物细胞的含水量随种类和生长期而异。通常 情况下，细菌含水量为细胞鲜重的75%～85%， 酵母菌为70%～85%，丝状真菌为85%～90%， 细菌芽孢和霉菌孢子的含水量约为40%。
石油代粮发酵的原料：
• 各种石油馏分：正烷烃，轻油，灯油等 • 各种石化产品：甲醇，乙醇，醋酸（for 谷氨酸、赖氨酸），乙二醇，丙二醇等
• 石油酵母菌体：为维生素B2和酶的生产提 供C、N源（间接石油发酵）
几乎所有糖发酵产物都可通过石油馏分发酵 获得
能源危机 CO2温室 效应 首选 纤 维 素
淀粉水解糖的制备方法
淀粉水解的方法
☆酸解法 ：无机酸，高温高压。副产物较多，转化率低。 ☆酶酸法 ：酸解为糊精或低聚糖，再酶解为葡萄糖。
☆酸酶法 ：α-淀粉酶液化，再用酸水解为葡萄糖。
☆双酶法
淀粉糖化方法比较
糖液质量
葡萄糖值（DE） 葡萄糖含量（%干基） 灰分（%） 蛋白（%） 颜色（透光率%） 淀粉对糖转化率（%） 工艺条件/耗能 副产物 生产周期 设备规模/防腐要求 原料适应情况 是否有利于发酵提取
不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜前处理的一般方法
1.加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法） 通风，沉淀，提高N、O2含量 2.加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法） 效果比方法1好，但是费时费设备，不适于大规模生产 3.添加絮凝剂澄清处理法 澄清效果较好 目的：通过稀释，酸化，灭菌，澄清，使之更适于发酵
谷氨酸发酵的糖蜜前处理
一、微生物的营养物质
营养物质按照它们在机体中的生理作 用不同，可以将它们区分成六大类。 1、碳源(Source of carbon) 2、氮源(Source of Nitrogen) 3、氧气(Oxygen) 4、水 (Water) 5、无机盐(Inorganic salt) 6、生长因子(Growth factor)
过滤→ 低糖 →阳离子交换柱→阴离子交换柱→三效 浓缩蒸发→高糖
双酶法制糖工艺
◆葡萄糖的理论收率
(C6H10O5)n+nH2O →nC6H12O6
162 18 180
理论收率是111.11%
◆葡萄糖的实际收率 实际收率 = 投入淀粉量(m) × 淀粉含量(ωc’) 糖液体积(V) × 糖液葡萄糖含量(ωc) ×100%
（C6H10O5）n ---→（C6H10O5）n---→ C12H22O11---→C6H12O6 淀粉 各种糊精 麦芽糖 葡萄糖 （1）理论转化率：葡萄糖/淀粉=180/162=111% （2）葡萄糖纯度DE=还原糖/干物质(%)
葡萄糖聚合度与碘液的呈色表
葡萄糖聚合度 7~8 16 21 28 34 41 61 120 330 与碘液呈色 无色 淡红色 红色 红紫色 紫色 兰紫色 兰色 兰色 兰色 最高吸收波长（nm)
可再生 生物质 CO零排放 不能作为食物 来源广泛
• 化石能源的不可再生性 • 温室气体 • 生物质资源的利用同时具有可再生和CO 零 排放的双重特征，完全符合可持续发展的 要求。纤维素是一种重要的生物质 • 资源，它不能作为人类食物，且来源极为 广泛，例如农作物的秸秆等。因而以纤维 素为原料制备能源化学品，是发展生物质 能源转化的首选方案。
待处理物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 处理目的：澄清→脱钙→脱除生物素
糖蜜预处理方法
①活性炭处理法 稀释，漂白粉，活性炭，过滤 ②树脂处理法 ③亚硝酸处理法 原理：破坏生物素
原理：吸附
还可以采用以下三种方法脱除生物素：
1.添加化学药剂处理法 原理：增加细胞膜对谷氨酸的渗透性
矿质元素的生理功能
6、生长因子
通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小， 但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生 长需要的有机化合物。 狭义：维生素 广义：维生素、氨基酸、嘌呤及嘧啶
二、培养基的类型 1.依营养物质的来源分类
①天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） ②合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等 ） ③半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖
淀粉的深加工
第三节
糖蜜前处理
一、糖蜜的来源与特点
二、糖蜜前处理的方法
三、谷氨酸发酵糖蜜前处理
糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产 物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。 糖蜜除含糖份外，还含有较多的杂质，其中有些是有 用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预 处理。
配制培养基的一般原则 1. 选用合适的营养物质 2. 确定各营养物的适当配比 3. 基质环境的调节 4. 营养原料的经济性
四、原料转换及意义
发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、 油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、 淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、 油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发 酵产品品种和产量与日俱增，每年都消耗大量粮 食、油料和蛋白质原料。
培养基）
2.依培养基制成的形式分：
①液体培养基； ②固体培养基；
3.依培养基主要成分和使用目的来分
①基础培养基 ②完全培养基 ③鉴别培养基 ④选择培养基
4.根据生产工艺来分
①孢子培养基 ②种子培养基 ③发酵培养基
附：培养基配方举例
三、发酵培养基的选择
发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实 验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；
支链淀粉结构
CH20H 0 0 0H CH2 0H 0 0 0H CH2 0H 0
0H
0H
0H
0H n
0H
0
CH2 0H 0 0H
0 0 0H
CH2 0H
0 0 0H
CH2 0H 0 0H 0H
支链淀粉(胶淀粉)其直链由葡萄糖分子以α-1,4-糖苷 键相连结,而支链与直链葡萄糖分子以α-1,6-糖苷键 相连结,分子呈树状,它是一种膨胀性的物质,置于水中 加热时成为胶粘的糊状物,而且只有在加热加压的条件 下,才能溶解于水,遇碘呈紫红色反应。