基因工程制药(2)

基因工程制药

(一) 概述

(二) 基因工程药物生产的基本过程

(三) 目的基因的获得

(四) 基因表达

(五) 基因工程菌的稳定性

(六) 基因工程菌生长代谢的特点

(七) 基因工程菌发酵

(八) 基因工程药物的分离纯化

(九) 基因工程药物的质量控制

(十) 基因工程药物制造实例

表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导

剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。 表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因

等。表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌

株。

组成型表达：：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一 组成型表达

直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。

诱导型表达：：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存 诱导型表达

在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。

融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。

分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。

可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag 有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。

(五)基因工程菌的稳定性

传代过程中常出现质粒不稳定的现象

分裂不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象（常见）。

结构不稳定:外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

一、质粒不稳定产生的原因

1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率

2.这两种菌的生长比速率差异的大小

对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：

含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性

含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利

基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制

受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA 分子的降解

外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序

重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配

受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

影响基因工程菌稳定性的因素

载体的选择

遗传特性宿主的选择

外源基因整合到宿主染色体上

培养基

生长速率

发酵工艺限制性基质

温度

pH 和溶氧

外源基因表达

无抗性平板质粒稳定性的分析方法

稀释

涂布培养10-12 h

随机挑选100个菌落

10-12 h 稳定性(ST, stability )

二、提高质粒稳定性的方法

两阶段培养法:

第一阶段先使菌体生长至一定密度

第二阶段诱导外源基因的表达

减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别 选择性压力：如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长

环境参数调控（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度）

改进载体受体系统

将R1 质粒上的parB基因引入表达型载体中表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞

正确设置载体上的多克隆位点

禁止DNA 片段插在稳定区内

将受体细胞的致死性基因安装在载体上

同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA 单链结合蛋白编码基因）

施加选择压力

根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素

加入大量的抗生素会使生产成本增加

添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间

添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力

载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高

优化基因工程菌的培养工艺

有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长

速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过

改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。

培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定

培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定

(六)基因工程菌生长代谢的特点

菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子—核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。

控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义。