基因工程制药(2)
常识考点生物技术的四大工程
生物技术的四大工程是指基因工程、生物制药、农业生物技术和环境生物技术。
这些工程在当代生物科技领域具有重要的地位和广泛的应用。
本文将从引言、概述、正文内容、总结等部分详细阐述这四大工程的相关知识。
引言：生物技术是指利用细胞、生物体以及生物分子进行研究和创新的技术，它具有广泛的应用领域，如医学、农业、环保等。
而生物技术的四大工程是在生物技术领域中应用最为广泛且影响最大的四个重要分支。
这四大工程是基因工程、生物制药、农业生物技术和环境生物技术。
概述：1.基因工程（Geneticengineering）基因工程是指通过改变和重组生物体的遗传物质来实现特定目的的技术。
它涉及到DNA分子的提取、修饰和重新组合。
基因工程的应用包括基因治疗、基因工艺和转基因技术等。
小点详述：（1）基因工程的原理和方法；（2）基因工程在医学领域的应用；（3）基因工程在农业领域的应用；（4）基因工程在工业生产中的应用；（5）基因工程的伦理与社会问题。
2.生物制药（Biopharmaceuticals）生物制药是指利用生物技术生产药物的过程。
这些药物是以细胞、组织和生物分子为基础的。
生物制药工程包括生物反应器设计、工艺优化和纯化技术等。
小点详述：（1）生物制药的发展历程；（2）生物制药的原理和流程；（3）生物制药在医学领域的应用；（4）生物制药的质量控制；（5）生物制药的发展前景。
3.农业生物技术（Agriculturalbiotechnology）农业生物技术是指利用生物技术手段提高农作物和动物的产量和质量的技术。
这包括常见的转基因农作物、动物遗传改良以及农业生物制剂等。
小点详述：（1）农业生物技术的发展历程；（2）转基因农作物的优缺点；（3）农业生物技术在动物遗传改良中的应用；（4）农业生物技术在农作物病害防治中的应用；（5）农业生物技术对环境的影响。
4.环境生物技术（Environmentalbiotechnology）环境生物技术是指利用生物技术手段解决环境问题的技术。
第二章基因工程制药
第一节
概 述
基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展
基因工程：
应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物
遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品
和服 务的技术。
一、基因工程技术生产药品的优点
1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。
超声破碎法
四、固液分离
分离细胞碎片常用的方法有：
1. 离心沉淀：高速离心、超速离心 2. 膜过滤：微滤、超滤和反渗透
3. 双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖
聚乙二醇-无机盐
五、重组蛋白质的分离纯化
分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括： 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。
发夹结构 RNaseH S1核酸
4．cDNA克隆
质粒 入噬菌体 酶、 定向、A T克隆
化 学 法 电 击 转 染
5．将重组体导入宿主细胞 差示 抗体 抗性获得 抗性失活 显色
二、大肠杆菌中的基因表达
2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数 （2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响
二、大肠杆菌中的基因表达
3．表达形式
（1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。
五、重组蛋白质的分离纯化
3. 亲和层析： 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非 常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既 是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这 种结合解除。
(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)
第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。
2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。
3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。
5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。
2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。
3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。
简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。
《基因工程制药》课程教学大纲
《基因工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1026课程名称：基因工程制药英文名称：Gene Engineering Pharmaceutical Science实验室名称：生物制药实验室（二）课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程是生物制药专业的专业实验课程，是以基因工程基本操作为主线，强调实验方法的经典性、实用性。
实验内容涉及了基因工程制备药物的主要过程，通过本课程的学习使学生掌握基因工程的一些基本原理和实验操作方法，并使其对基因工程制药的上、下游技术有一个完整的概况，力求全面、系统地培养学生基因工程制备药物的实验操作能力，并提高解决问题及分析研究问题的能力，为本科生进入科研实验室打下良好的基础。
二、主要仪器设备及现有台套数恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、电子天平、微量移液器、凝胶成像系统、超净工作台、台式离心机、旋涡混合器、磁力搅拌器、琼脂糖凝胶电泳槽、电泳仪、PCR仪、水浴锅、垂直电泳槽、发酵罐、电转仪。
微波炉、脱色摇床、制冰机三、实验课程内容和学时分配四、考核方式1、实验报告：本门课程要求实验报告应具有“实验目的与要求、原理、实验基本过程、实验结果与讨论”等几个方面的内容。
2、考核方式（1）实验课的考核方式：本课程按等级制评定与考核，评分标准分为：A、B、C、D、E五个等级。
考核主要包括两部分：实验操作技能、实验报告（包括实验预习报告）。
（2）实验课考核成绩确定，实验课成绩占课程总成绩的比例等：在该课程的评定分数中，实验课内容占30%，其中实验课考核又分为两部分，即实验操作技能占实验课总分数的60%、实验报告（包括实验预习报告）占实验课总分数的40%。
五、实验教材、参考书1、教材：自编参考楼士林主编《基因工程》，科学出版社20072、参考书目：（1）基因工程技术实验指导，钟卫鸿主编，化学工业出版社 2007（2）基因工程实验指导，朱旭芬主编，高等教育出版社，2006（3）基因工程实验技术，彭秀玲编著，湖南科学技术出版社 1997《酶工程制药》实验教学大纲课程代码：BIOP1027课程名称：酶工程制药英文名称：Enzyme Engineering Pharmaceutical science实验室名称：药学院实验中心生物制药实验室课程学时：90实验学时：36一、本课程实验教学目的与要求本课程实验教学的目的是让学生掌握酶制剂的发酵生产方法、酶的固定化原理与操作方法、酶分子的修饰原理和实验方法等，加深学生对抽象的理论内容的理解；通过实验训练，培养学生的动手操作能力和观察能力，正确掌握实验仪器的使用方法和实验操作技能，培养学生独立解决问题的能力和严谨的科学态度。
基因工程制药
第三章基因工程制药第一节：基因工程制药基本环节基因工程技术六个基本过程：分离→酶切→连接→转化→筛选→验证。
（一）基因工程中常用的工具酶：ⅰ：核酸限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶，简称内切酶。
主要存在于原核微生物中。
（1）限制和修饰系统：原核微生物中存在限制性内切酶及甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。
而甲基化酶具有宿主专一性，可识别宿主双链DNA分子的特定序列进行甲基化修饰，而不修饰外源性DNA分子，从而避免了限制酶对宿主DNA的降解。
（2）限制性内切酶的分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
其中Ⅱ型限制性内切酶识别和切割产物是特异性的。
（3）Ⅱ型核酸限制性内切酶：1．酶切方式有两种：①断裂位置交错，形成粘性末端，又可分为从5′粘性末端和3′粘性末端；②对称轴处断裂形成平头末端。
2．同裂酶：是指来源不同，识别序列相同的酶，其切割位点同，产生平头或粘性末端。
3．同尾酶：来源和识别序列都不同，但切割后产生相同的粘性末端的酶。
4．限制性内切酶产生的末端的连接方式有三种：①匹配粘性末端的连接②平端连接③不匹配粘性末端的连接（有两种：67）5．限制性内切酶反应的影响因素：DNA的纯度、反应速度、反应体系的缓冲液、酶量、体积、时间、DNA甲基化程度、DNA的分子构型等。
ⅱ：DNA连接酶：是指催化两条分别具有5′-磷酰基末端与3′-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。
目前使用的DNA连接酶:T4噬菌体DNA 连接酶、大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶。
特点1．T4-连接酶：能够连接含粘性末端或平头末端连接的DNA片段或双链DNA 的切口。
连接反应中 ATP+作能源辅助因子。
2．大肠杆菌：只能连接粘性末端DNA片段或双链DNA的切口，不能连接平头末端DNA片段。
在连接反应中用NAD+作能源辅助因子。
ⅲ：聚合酶：（68）（二）载体：概念：（1）载体：是指凡来源于质粒或噬菌体的ＤＮＡ分子，可以供插入或克隆目的基因ＤＮＡ并具有运载外源ＤＮＡ导入宿主细胞能力的片段。
基因工程制药
基因工程制药基因工程制药是指利用生物技术手段，通过基因克隆、遗传工程、细胞培养等技术制备的药物。
相比传统的制药技术，基因工程制药具有高效、精准、无毒副作用等优点。
本文将从基因工程制药的概念、制备过程、应用、发展现状等方面进行介绍。
一、基因工程制药的概念基因工程制药是指利用遗传工程技术，将DNA序列插入到细胞内，使细胞能够表达人类所需的有效蛋白质，从而制备出符合医疗需求的药物。
基因工程制药的研发已成为制药业的重要领域，具有广阔的市场前景和潜力。
二、基因工程制药的制备过程基因工程制药的制备过程包括基因选择、基因克隆、载体构建、转染细胞、发酵培养和纯化等步骤。
1、基因选择基因工程制药的制备过程首先要选择适合人体治疗的基因，可以是已知的治疗目标基因，也可以是新发现的疾病相关基因。
2、基因克隆基因克隆是将目标基因从DNA分子复制到载体上的过程。
其中包括PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，最终得到包含目标基因的重组载体。
3、载体构建为了使目标基因的表达量达到较高水平，需要将目标基因克隆到适合的载体中。
典型的载体包括质粒和病毒。
4、转染细胞将重组载体转染到宿主细胞中，宿主细胞将目标基因表达成蛋白质。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞和真菌等。
5、发酵培养将转染后的细胞进行大规模培养，加入培养基和营养成分，进行培养和生长。
由于基因工程制药药物的生产量较大，通常采用发酵技术进行生产。
6、纯化将发酵得到的药物纯化出来，使其达到医药级别要求。
通常采用多种分离纯化技术，如超滤、离子交换和透析等，得到纯度高、活性好的药物制剂。
三、基因工程制药的应用基因工程制药已经广泛应用于多种疾病的治疗中，如慢性病、肿瘤、代谢性疾病和遗传性疾病等。
其中常见的基因工程制药药物有类风湿关节炎药物、肿瘤靶向药物、生长激素、重组人胰岛素和重组人血小板等。
1、类风湿关节炎药物抗肿瘤类药物通过影响免疫系统来治疗类风湿关节炎。
这些药物通常在类风湿关节炎患者无法耐受非甾体类抗炎药物和光合作用药物时使用。
生物技术制药-第二章-基因工程制药(201309-201401-2)
7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA
DNA聚合酶I Klenow片段
ds-cDNA 核酸酶S1
ds-cDNA
二、逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）
1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。
特异引物 mRNA 逆转录酶 ss-DNA PCR 目的cDNA链
优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养 液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费 用高，培养液浓度稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 表达载体必须具备的条件
（1）载体能独立地进行复制 (复制起点，ori)
（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记
核酸酶S1
第三节 目的基因的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合 成法。（不能直接分离？）
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再 反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。
逆转录法的步骤
1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆
利用基因工程技术生产药品的优点：
（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋 白和多肽； （2）可以提供足够数量的生理活性物质；
（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的
内源性生理活性物质；
（4）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除 内源性生理活性物质的不足之处。 （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，
又分为普通表达载体和精确表达载体
基因工程制药
PCR扩增目的基因片段用Taq DNA聚合酶
33
限制性核酸内切酶：识别特异序列，切割DNA
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特 定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制 酶有200多种。
34
4.2、限制性核酸内切酶酶切DNA的方法 ※ 单酶切法: 用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品 是环状DNA分子,完全酶切后,产生与识别序列数(n)相 同的DNA片段数, 并且DNA片段的两末端相同。
简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能 性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码
子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号 外还出现如R、Y、M、K等其它字母
引物酶切位点的确定
目的基因片段 内切酶需要的最低保护碱基的数目
26
1.3.2 紫外光分光光度计法
※ DNA或RNA分子，蛋白质和多糖类分别在紫外光260nm，
280nm和230nm处有特异吸收峰。吸收强度（OD）与系统 中各分子浓度成正比。 ※ DNA或RNA的含量 双链DNA浓度（ug/ml）＝50 OD260 稀释倍数 单链RNA浓度（ug/ml）＝40 OD260 稀释倍数 ※ DNA或RNA的质量的判断标准
※ 双酶切法:
用两种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种 DNA分子
的方法。DNA分子无论是环状 DNA分子, 还是线形
DNA片段, 酶切结果，DNA片段的两个粘性末端是不 同的( 用同尾酶酶切除外)
35
限制性核酸内切酶反应事项:
1 、反应系统除酶本身外 , 还应包括反应底物、反应缓冲液 （双酶切最好选用同意缓冲溶液)和合适的反应温度。
基因工程制药2课件
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
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外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
03-1 基因工程制药
生物技术制药3 基因工程制药现代生物技术的发展◆1973Cohn S.N.和Boyer H.完成了DNA体外重组，一举打开基因工程学大门。
◆1976Swanson与Cohn合作，全球第一家生物技术公司—Genentech公司问世。
两年后该公司首次用基因工程技术在大肠杆菌中表达和生产胰岛素。
◆1981第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用。
◆1988美国Kary Mullis发明PCR技术。
◆1997英国科学家Wilmut等人完成了首例哺乳动物—绵羊“多利”的克隆。
第一个重组体的构建1972年，美国斯坦福大学的P. Berg博士率先完成了DNA体外重组试验。
（分享1982年诺贝尔化学奖）猿猴病毒SV40 DNA + λ嗜菌体DNA EcoR1 T4DNA连接酶重组DNA第一个重组体的构建1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus40:circular SV40DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia A69:2904-2909,1972”。
SV40病毒5基因工程技术的诞生具有性状功能的基因能否重组？1973年，美国斯坦福大学的S.Cohen等人成功地进行了另一个体外DNA重组试验，在体外构建出含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子。
R6-5 + pSC101 EcoR1 T4DNA 连接酶重组DNA 转入大肠杆菌重组菌Kan r Tet r Kan r+ Tet rThe fathers of genetic engineeringHerbert Boyer Stanley Cohn1973年DNA分子体外拼接pSC101质粒DNA8Boyer and Cohen 的策略flash\1基因工程技术的诞生不同物种、尤其是真核基因能否在原核生物中重组与表达？1974年，S.Cohen 与H.Boyer合作进行了如下试验，结果表明：动物基因的确可以进入大肠杆菌细胞，并转录出相应的RNA 。
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
基因工程制药新教材
用途： ❖ 给载体或cDNA加上同聚尾。 ❖ 3‘末端用32P标记的dNTP标记。 ❖ 利用非放射性标记物生物素-11-dUTP渗入到
DNA片段分子的3’末端。
第二部分：基因工程的载体
一、概述 载体的概念（Vector）：凡来源于质粒 或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克 隆目的基因并具有传递运载外源DNA导 入宿主细胞能力的DNA片段称为载体。
特定序列体外扩增(产物为粘末端）；
pfu DNA Polymerase ❖ 有DNA聚合酶活性 ❖ 没有逆转录活性 ❖ 有3‘-5’方向的外切酶活性. 产物为平末端 ❖ 但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。 常用于PCR反应 ❖ 高保真
（三）、逆转录酶(reverse transcriptase) 1 特性： ❖ 依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的
2 技术上三大发明 ❖ 限制性内切酶和连接酶的发现 ❖ 载体（Vector）的发现：载体相当于运送重组
DNA分子到宿主细胞的车子 ❖ 逆转录酶的发现，打破了中心法则，使真核基
因的制备成为可能
一、重组DNA技术的基本过程 ❖ 基因工程要素 ❖ 目的基因的制备和分离 ❖ DNA重组体的构建 ❖ DNA重组体扩增和表达 ❖ 重组体筛选和鉴定 ❖ 外源基因的表达 ❖ 表达产物的分离纯化、鉴定
5‘GTT-3’ 3‘CAA-5’
5‘AAG-3’ 3‘-TTG-5’
5‘-粘末端
5‘CTGCAG-3’ Pst I
5‘CTGCA-3’
3‘GACGTC-5’
3‘-G
3‘粘末端 EcoR I
5‘GAATCC-3’ 3‘CTTAAG-5’
5‘-G-3’ 3‘CTTAA-5’
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基因工程制药(一) 概述(二) 基因工程药物生产的基本过程(三) 目的基因的获得(四) 基因表达(五) 基因工程菌的稳定性(六) 基因工程菌生长代谢的特点(七) 基因工程菌发酵(八) 基因工程药物的分离纯化(九) 基因工程药物的质量控制(十) 基因工程药物制造实例表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。
表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌株。
组成型表达：：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一 组成型表达直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。
这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。
诱导型表达：：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存 诱导型表达在的条件下才能表达目的产物。
这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。
另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。
对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。
His-Tag是最广泛采用的Tag。
分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。
通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。
可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。
分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag 有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
(五)基因工程菌的稳定性传代过程中常出现质粒不稳定的现象分裂不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象（常见）。
结构不稳定:外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
一、质粒不稳定产生的原因1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率2.这两种菌的生长比速率差异的大小对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA 分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排影响基因工程菌稳定性的因素载体的选择遗传特性宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上培养基生长速率发酵工艺限制性基质温度pH 和溶氧外源基因表达无抗性平板质粒稳定性的分析方法稀释涂布培养10-12 h随机挑选100个菌落10-12 h 稳定性(ST, stability )二、提高质粒稳定性的方法两阶段培养法:第一阶段先使菌体生长至一定密度第二阶段诱导外源基因的表达减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别 选择性压力：如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长环境参数调控（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度）改进载体受体系统将R1 质粒上的parB基因引入表达型载体中表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点禁止DNA 片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA 单链结合蛋白编码基因）施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高优化基因工程菌的培养工艺有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。
通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定(六)基因工程菌生长代谢的特点菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子—核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。
工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。
控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义。
对菌体生长的调控主要有两种观点：一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率另一种认为是小分子前体和催化组分等的限制决定了菌体的最大比生长速率一、菌体生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分。
碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。
导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。
适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。
分批培养中选择不同的碳源，补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。
以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。
二、菌体生长与前体供应的关系菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构中等拷贝质粒数：相关酶的相对水平增加高拷贝质粒数：前体不足，严紧反应“严紧反应”：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，并合成称为“魔点”的ppGpp的结果。
ppGpp：一个重要的调控分子。
它通过影响RNA链的延深过程减少转录。
其浓度的增加导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子的转录减少。
(七) 基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程(1) 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；(2) 通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养原料发酵培养灭菌发酵生产代谢产物分离基配制菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养原料发酵培养灭菌发酵生产代谢产物分离基配制微生物工业发酵过程简图一、基因工程菌的培养方式1.补料分批培养2.连续培养3.透析培养4.固定化培养1、补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。
为保持基因工程菌生长所需的良好环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生长规律来调节补料速率。
2、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。
基因工程菌的两阶段连续培养:①工程菌的生长阶段②基因的表达阶段关键控制参数：诱导水平、稀释率、细胞比生长速率3、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。
膜透析装置4、固定化培养维持质粒的稳定性基因工程菌固定化后，质粒的稳定性大大提高。
便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。
二、基因工程菌的发酵工艺获得微生物自身基因表达所产生的初级或次级代谢产物获得大量外源基因表达产物生产目的不含外源基因带外源基因重组载体生物材料(微生物)传统微生物发酵基因工程菌发酵基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。
对发酵影响较大的几个因素有：⒈培养基的影响⒉接种量的影响⒊温度的影响⒋溶解氧的影响⒌诱导时机的影响⒍pH的影响1、培养基的影响提高工程菌生长速率，保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等葡萄糖做碳源菌体产生的副产物较多，对lac启动子有阻遏作用；甘油做碳源菌体得率较大常用的氮源:酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等酪蛋白水解物做氮源有利于产物的合成与分泌其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。
接种量：移入的种子液体和培养液体积的比例。
接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度，影响发酵的产量和发酵周期接种量小：生长延迟期较长，不利于外源基因的表达接种量大：缩短生长延迟期，减少污染机会接种量过高：代谢产物累积过多，抑制后期菌体的生长2、接种量的影响3、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上复制水平：通过调控复制，改变基因拷贝数转录水平：影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶mRNA降解和翻译水平细胞内小分子调节分子的量影响细胞内ppGpp量影响蛋白质的活性和包含体的形成4、溶解氧的影响影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值（>40%）>40%） 调节搅拌转速法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量5、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达6、pH的影响pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响细胞生长期最pH范围：6.8－7.4外源蛋白表达pH范围：6.0－6.5三、基因工程菌的培养设备应用发酵罐大规模培养基因工程菌。
它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。