食品中黄曲霉毒素测定
实验十一-食品中黄曲霉毒素B1的检测
4．植物油：
用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移 于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶 液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油 4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再 加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲 醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液 重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下 按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
二、实验原理：
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉 毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应， 多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入 酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。
三、仪器与试剂
（一）试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板； 2、抗体； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg×4）； 6、底物液A； 7、底物液B； 8、终止液； 9、PBS一T洗液； 10、一次性手套。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。
5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操 作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1 甲醇一PBS(20＋80)中。
（二）样品测定
1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； 底物液A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）； 阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻
3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）：
样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确 加人100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封 严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于 125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧 杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏 斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现 象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加 5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一 并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
食品中黄曲霉毒素检测方法概述
食品中黄曲霉毒素检测方法概述黄曲霉毒素是由黄曲霉菌（Aspergillus flavus和Aspergillus parasiticus）产生的一类有害物质，可存在于多种食品中，包括谷物、豆类、坚果、麦芽、果蔬等。
长期摄入含有黄曲霉毒素的食品可能对人体健康造成严重影响，如致癌、免疫毒性、肝毒性等。
对食品中的黄曲霉毒素进行检测具有重要意义。
目前，根据国内外相关标准和技术，已经发展了各种不同的黄曲霉毒素检测方法。
常用的黄曲霉毒素检测方法主要包括物理方法、生化方法和分子生物学方法。
一、物理方法：1. 目视法：通过观察食品外观和质地等特征，判断食品是否受到黄曲霉毒素污染。
这种方法简单易行，但只适用于一些直观的食品，如坚果。
2. UV检测法：利用紫外光的特性，根据黄曲霉毒素的吸收特征，通过分析样品吸收的紫外光谱，间接判断样品中黄曲霉毒素的含量。
二、生化方法：1. 水溶性黄曲霉毒素试纸法：将食品样品与特定试剂反应，产生特定的颜色反应，通过颜色的变化判断样品中黄曲霉毒素的阳性与阴性。
这种方法操作简单、快速，可用于野外快速检测，但精确度有限。
2. 高效液相色谱法（HPLC）：通过将样品中的黄曲霉毒素分离和定量测定，实现样品中黄曲霉毒素的检测。
HPLC方法精确度高，可靠性强，被广泛应用于黄曲霉毒素的检测与分析。
三、分子生物学方法：1. PCR法：利用聚合酶链反应（PCR）技术，通过选择性引物扩增样品中黄曲霉毒素基因的特异序列，最终实现对黄曲霉毒素的检测。
2. 免疫学方法：包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫扩散法。
ELISA法通过特异性抗体与黄曲霉毒素结合，形成抗原-抗体复合物，通过测定复合物的光学密度来判断样品中黄曲霉毒素的含量。
总结而言，食品中黄曲霉毒素检测方法多种多样，根据不同的需求可以选择适当的方法进行检测。
无论采用何种方法，都必须满足准确、快速、灵敏、可靠的检测要求，以确保食品的安全性。
对食品中黄曲霉毒素B1的检测方法及分析
２０１０ ＮＯ．２３S c i enc e a nd T ech n ol o gy I nno v at i on Her a l d研 究 报 告1 黄曲霉毒素B t测定原理与步骤方法在食品中黄曲霉毒素B1检测方法很多,有些样品如薯类及部分酱料、油类样品受样品杂质干扰的影响,因而使方法的灵敏度降低。
目前通常采用双向展开法,可以提高了检测方法的灵敏度,如测定了一份薯类样品,按灵敏度由原法的25ppb提高到5ppb,同时测定了含杂质较多的花生油、酱油及曲种等样品,情况亦是如此。
而原法灵敏度为5ppb的样品(如花生及部分花生油样品等)用双向展开法展开,其灵敏度亦可以进一步提高,有的可提高到1.25ppb。
今将双向展开法的原理及操作步骤介绍如下。
1.1原理因无水乙醚不能推动黄曲霉毒素B-(以下简称B。
)。
在用乙醚将薄层板横展时,可以把干扰的杂质推到样品点的旁边,而不像用乙醚纵展时,有时在样品的过道中留有部分杂质的底色。
在乙醚横展后再用丙酮:氯仿纵展,可以使样品在B1标准点相应处的杂质底色大量的减少.从而提高了原有方法的灵敏度。
1.2试剂(补充的)无水乙醚,分析纯,在无水乙醚中加入少许无水硫酸钠贮存。
1.3操作步骤主要补充双向展开法的操作步骤,其它参照B1测定法。
1.3.1滴加方法由于在具体测定条件下,用无水乙醚展开后Bt仍有很少的移动(因无水乙醚中含微量的水或醇以及空气中的湿度太大等均可以使B,移动),因此在滴加时必需同时滴加两块层析板。
在一块5×20cm的薄层板上距下端3cm的基线上滴加以下两个点:第1个点离左边边距0.8～1cm处滴加B。
标准液Ⅲ(0.04微克/毫升)10微升;第2个点离第一个点的间隔距离约1.8～2.0cm处滴加样液20微升。
在另一块上的滴加样式完全与第一块相同,祗在第二个样品点上再滴加B1标准液Ⅲ0.04(微克/毫升)10毫升。
1.3.2展开方法①横展:在展开槽内的长边放置玻璃支架一个,再加无水乙醚10毫升。
食品中黄曲霉毒素检测方法概述
食品中黄曲霉毒素检测方法概述黄曲霉毒素是一种由黄曲霉属真菌产生的毒素，它主要存在于一些谷物和豆类等食品中。
长期摄入过量的黄曲霉毒素会对人体健康造成严重危害，包括肝脏损伤、免疫抑制、致癌和致突变等。
对食品中的黄曲霉毒素进行检测至关重要。
黄曲霉毒素检测的方法通常可以分为生物学法、生化法和物理化学法等多种类型，每种方法都有其特点和适用范围。
本文将对食品中黄曲霉毒素检测的常见方法进行概述，以期加深对这些方法的认识和理解。
一、生物学法1.担体法担体法是一种常见的黄曲霉毒素检测方法，其原理是利用含有特定受体蛋白的担体来结合毒素，然后通过测定结合后的复合物来检测毒素的含量。
担体法可以分为放射性担体法、酶标记担体法和免疫检测法等。
这些方法具有检测灵敏度高、特异性好和操作简便等优点，但也存在着高成本和对设备、试剂和技术人员的要求高等缺点。
2.胚胎法胚胎法是一种利用胚胎生物对黄曲霉毒素进行毒性测定的方法，其原理是将黄曲霉毒素溶液与受精鸡卵一起触发孵化，然后观察胚胎的死亡率和畸形率等指标来评价毒素的毒性。
胚胎法具有检测方法简便、成本低廉和结果可靠等优点，但也存在着操作繁琐、耗时长和对实验条件的要求严格等缺点。
二、生化法1.高效液相色谱法高效液相色谱法是一种利用液相色谱仪对食品样品中的黄曲霉毒素进行定量分析的方法，其原理是首先将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后通过液相色谱技术对其进行分离和检测。
高效液相色谱法具有分析速度快、灵敏度高和分辨率好等优点，但也存在着设备昂贵、操作复杂和需要专业技术人员等缺点。
食品中黄曲霉毒素检测方法有着不同的特点和适用范围，选择合适的检测方法需要综合考虑样品的特性、检测要求和实验条件等因素。
希望本文的概述能够为相关领域的科研工作者和食品生产企业提供一定的参考和帮助，促进食品中黄曲霉毒素检测技朧的进步和完善。
实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素
实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素一、实验目的了解ELISA的基本原理，及其优缺点；掌握间接ELISA法的试验操作过程。
二、实验原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。
本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。
将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。
三、实验器材1、ELISA试剂盒其组成如下：1.1 包被抗体的反应板48孔1.2 A试剂：样品稀释液l瓶1.3 B试剂：AFB1标准溶液l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)1.4 C试剂：酶标抗原l瓶1.5 D试剂：酶标抗原稀释液l瓶1.6 E试剂：浓缩洗涤液l瓶1.7 F试剂：显色底物液a l瓶1.8 G试剂：显色底物液b l瓶1.9 H试剂：终止液l瓶1.10 反应板框架l块2、仪器1.1酶标仪(内置450nm滤光片)1.250µL微量移液器及配套吸头1.3 恒温培养箱(0℃-50℃)1.4冰箱(4℃-8℃)1.5 感量0.0lg的天平1.6调速振荡器或超声波清洗器1.7 离心机5000r/min1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等1.8 小型粉碎机或碾钵1.9其它：滤纸，吸水纸等四、实验步骤1、实验准备1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表”1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。
食品中黄曲霉毒素检测方法概述
食品中黄曲霉毒素检测方法概述黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌（Aspergillus flavus和Aspergillus parasiticus）和黄曲霉菌（Penicillium verrucosum）产生的毒素。
这些毒素经常出现在各种食品（包括玉米、花生、大米、小麦、各种豆类、香料等）中，并已被证明对人类和动物的健康产生了严重的负面影响。
因此，为了确保食品的安全和质量，必须对黄曲霉毒素进行检测。
这篇文章将重点介绍几种常见的食品中黄曲霉毒素的检测方法。
1. 便携式分析仪便携式分析仪是测试食品中黄曲霉毒素非常便捷的一种方法，例如五羰基二氧化钒分析仪（VICAM），可以快速检测大麦、燕麦、小麦、小米和高粱等谷物中的黄曲霉毒素。
这种测量方法对于食品加工厂、农民和小商贩等需要迅速测试黄曲霉毒素的人来说非常有用。
2. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛用于黄曲霉毒素检测的方法。
这是一种分析化学方法，它可以通过将食品中的黄曲霉毒素分离出来，然后使用UV或荧光检测器进行检测。
HPLC法可以检测多种黄曲霉毒素，包括黄曲霉素和掌状芽孢菌毒素等，同时它也是准确、可重复的方法。
不过这种方法需要专业技能的人员，并且设备价格比较昂贵。
3. 气相色谱-质谱法气相色谱-质谱法（GC-MS）是一种常用的现代技术。
与HPLC相比，它可以检测更广泛的黄曲霉毒素，包括黄曲霉酮和芜湖霉素等。
GC-MS法有高效的分辨能力，可以清晰地分析样品中不同的毒素种类、含量和结构等信息。
但是与HPLC相比，GC-MS需要更加昂贵的仪器和更高的技术要求。
4. 免疫学方法免疫学方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫色谱法。
这些方法基于特定的抗体和抗原的反应，可以检测食品中的黄曲霉毒素。
这些方法具有快速、高通量和灵敏度高等优点，同时在大规模食品安全检测中也有很高的可靠性。
但是，这些方法的不足之处是需要求样品的抽提质和反应基质的影响。
综上所述，不同的方法都有各自的优缺点，对于食品生产企业和监管部门来说，需要根据具体的需求选择合适的黄曲霉毒素检测方法。
食品中黄曲霉毒素检测方法概述
食品中黄曲霉毒素检测方法概述黄曲霉毒素是一种常见的食品毒素，主要是由黄曲霉菌产生的，能够污染谷物、豆类、坚果等多种食品。
黄曲霉毒素不仅对人体健康造成威胁，还会对食品质量和安全造成影响。
食品中黄曲霉毒素的检测十分重要。
针对不同食品中黄曲霉毒素检测的特点和要求，科学家们开发出了多种检测方法，以保障食品安全和人体健康。
一、化学分析法化学分析法是目前最为常用的食品中黄曲霉毒素检测方法之一，它包括了高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱质谱联用法（LC-MS/MS）等多种技术手段。
这些方法通过分离和检测食品中的黄曲霉毒素，能够快速准确地确定食品样品中的黄曲霉毒素含量。
HPLC和GC是较为常用的方法，它们能够对黄曲霉毒素进行有效的分离和检测，具有灵敏度高、结果稳定可靠的特点。
而LC-MS/MS技术结合了液相色谱和质谱的优势，不仅能够对黄曲霉毒素进行高效分离，还能够确定其结构和含量，因此在食品中黄曲霉毒素的检测中具有重要意义。
二、免疫学检测法免疫学检测法是另一种常用的食品中黄曲霉毒素检测方法，它主要利用抗体与黄曲霉毒素之间的特异性结合来进行检测。
免疫层析法（IA）、酶联免疫吸附法（ELISA）等技术被广泛应用于食品中黄曲霉毒素的检测。
这些方法具有操作简便、快速、高效等特点，能够在短时间内准确地进行黄曲霉毒素的定量检测。
免疫学检测法还可以进行高通量检测，适用于大批量食品样品的检测，因此在食品安全监测中具有重要的应用前景。
生物学检测法是近年来新兴的食品中黄曲霉毒素检测方法，它利用生物传感器和生物标记等技术手段来进行食品中黄曲霉毒素的检测。
生物传感器是一种利用生物成分对特定物质进行特异性识别的检测技术，其具有灵敏度高、结果快速等优点，因此逐渐受到人们的关注。
生物标记技术则是通过对黄曲霉毒素分子进行标记来进行检测，其具有对食品样品中黄曲霉毒素进行直接、快速的检测的特点。
由于生物学检测法具有操作简便、快速、准确等特点，因此在食品中黄曲霉毒素的检测中具有广阔的应用前景。
食品中黄曲霉毒素B1的测定
Science &Technology Vision 科技视界操作次序加入量孔号123456789150微升50微升A 00.10.250.512……DCCC C C CCC混匀23孔号234567891.890 1.548 1.2410.9190.6700.509 1.586 1.5400引言黄曲霉毒素B 1是一种高毒性、高致癌性的物质,除可引发肝癌外,也可引起其他部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿,是食品卫生部门常规的检测项目之一。
之前的方法都不能更好的检测出粮食作物、饲料和发酵食品中黄曲霉毒素的含量,今用酶联免疫吸附法能更灵敏准确的检出。
该法是把抗原抗体免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种新型检测技术,其主要依据有三点:第一,抗原(抗体)能结合到固相载体的表面并仍保持其免疫活性;第二,抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性;第三,结合物与相应的抗原(抗体)反应后,结合的酶仍能催化底物生成有色物质,而颜色的深浅可定量抗体(抗原)的含量。
酶联免疫吸附分析法主要有三种测定方法:即间接法、抗体夹心法和竞争法。
前两种主要用于测定抗体和大分子抗原,适用于临床诊断上;而竞争法是测定小分子抗原的方法,因而尤其适用于食品卫生分析,该法主要有四步:1)将人工抗原吸附于固相载体,温育后清洗;2)加入含有抗原的待测液和抗体,温育后洗涤;3)加入酶标抗体,温育后清洗;4)加酶底物,温育后显色,并进行检测和结果判断。
图1黄曲霉毒素化学结构1实验部分1.1酶联免疫吸附法的原理利用固相酶联免疫吸附原理,将AFB 1特异性抗体包被与聚苯乙烯微量反应板的空穴中,再加入样品提取液(未加抗原)及酶标AFB 1抗原(已知抗原),使两者与抗体之间进行免疫竞争及应,然后加酶底物显色,颜色的深浅取决于抗体和酶标AFB 1抗原结合的量,即样品中AFB 1多,则被抗体结合酶标AFB 1抗原少,颜色浅,反之则深。
黄曲霉菌含量测定标准
黄曲霉菌含量的测定标准通常是根据食品安全和卫生要求来制定的。
以下是一般情况下的黄曲霉菌含量测定标准：
1. 国际标准：根据国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission）的相关标准，黄曲霉菌毒素B1的限量为4微克/千克（ppb），而黄曲霉菌总毒素（包括B1、B2、G1、G2等）的限量为10微克/千克（ppb）。
这些标准主要适用于粮食、谷物和其它食品。
2. 国家标准：各个国家可能会根据本地的食品安全法规和监管要求，制定特定的黄曲霉菌含量标准。
以中国为例，国家标准GB 2761-2017中规定了不同食品中黄曲霉菌毒素的限量要求，如粮食及其加工品中黄曲霉菌毒素B1的限量为5微克/千克（ppb），饲料中为20微克/千克（ppb）等。
3. 行业标准：某些特定行业可能会根据自身的特殊要求，制定适用于其产品的黄曲霉菌含量标准。
例如，酿酒行业可能会有针对酿酒原料和成品酒的黄曲霉菌含量限制。
需要注意的是，不同食品类别、国家或地区的标准可能会有所不同。
因此，在具体情况下，最好参考相应的法规和标准来确定黄曲霉菌含量的测定标准。
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素是引起动物和人类食物中毒的常见真菌毒素之一。
为了确保食品的安全和质量，需要对食品样品中的黄曲霉毒素进行检测。
下面介绍几种常用的黄曲霉毒素检测方法。
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC是一种常用的分离、鉴定和测定食品中黄曲霉毒素的方法。
该方法使用高效液相色谱仪通过不同的分离柱，将样品中的黄曲霉毒素与其他组分分离开来，并根据其唯一的吸收特性进行检测和定量测定。
2. 气相色谱法（GC）：GC是一种基于样品中物质的挥发性的分离和检测方法，可以用于测定黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。
该方法需要将样品进行预处理，如萃取、净化等，然后通过气相色谱仪进行分离和检测。
3. 免疫测定法：免疫测定法是一种基于抗原与抗体特异性结合的原理进行黄曲霉毒素检测的方法。
常见的免疫测定法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。
这些方法操作简便、快速，可以实现对大量样品的高通量检测。
4. 质谱法：质谱法是一种可靠的黄曲霉毒素检测方法。
质谱法主要包括质量光谱（MS）和质谱联用技术（LC-MS/MS）。
这些方法通过样品中黄曲霉毒素的特征峰进行检测和定量，并具有高灵敏度和高选择性的优势。
以上是几种常用的黄曲霉毒素检测方法，每种方法都有其优缺点，选用合适的方法应根据样品特性、设备条件、经济性和检
测需求来决定。
为了确保食品的安全，建议将不同的检测方法结合使用，以提高检测的准确性和可靠性。
食用油黄曲霉毒素标准
食用油黄曲霉毒素标准黄曲霉毒素是一种具有强烈毒性和致癌性的真菌毒素，主要污染粮食、食用油等食品。
为确保食品安全，各国纷纷制定了严格的黄曲霉毒素检测标准和相关限量标准。
本文将简要介绍食用油黄曲霉毒素的标准，包括限量标准、检测方法及我国的相关政策。
一、国际限量标准1.欧盟：欧盟对黄曲霉毒素B1的限量标准为20μg/kg，黄曲霉毒素总量限量为4μg/kg。
涉及食品包括玉米、花生、花生油、坚果和干果（如核桃、杏仁等）。
2.美国：美国对黄曲霉毒素B1的限量标准为20μg/kg，其他种类食品的限量标准与中国类似。
3.世界卫生组织（WHO）和世界粮农组织（FAO）：这两个国际组织建议各国采用黄曲霉毒素B1限量标准为10μg/kg，并针对不同食品制定了相应的限量规定。
二、我国限量标准我国针对不同食品制定了以下黄曲霉毒素限量标准：1.玉米、花生、花生油：黄曲霉毒素B1限量为20μg/kg，黄曲霉毒素总量限量为4μg/kg。
2. 大米、其他食用油（如香油、菜籽油、大豆油等）：黄曲霉毒素B1限量为10μg/kg。
3.麦类、面粉、薯干等粮食制品：黄曲霉毒素B1限量为5μg/kg。
4.发酵食品（如酱油、食用醋、豆豉、腐乳制品等）：不得检出黄曲霉毒素。
5.乳及乳制品、新鲜猪组织（如肝、肾、血、瘦肉等）：黄曲霉毒素B1限量为0.5μg/kg。
三、检测方法为保证食品中黄曲霉毒素检测的准确性和可靠性，我国采用了多种检测方法，包括：1.高效液相色谱法（HPLC）：适用于食用油、粮食等样品中黄曲霉毒素B1的检测。
2.酶联免疫法（ELISA）：适用于各类食品中黄曲霉毒素的快速检测。
3.荧光定量PCR法：适用于黄曲霉毒素基因的定量检测。
4.食用油黄曲霉毒素检测仪：采用进口荧光微球，稳定性高，检测速度快，适用于各类企业、检测机构和政府部门。
四、总结食用油黄曲霉毒素标准为确保食品安全提供了重要依据。
通过严格的限量标准和高效的检测方法，有助于防止黄曲霉毒素污染的食品进入市场，保障消费者健康。
食品中黄曲霉毒素的测定
食品中黄曲霉毒素的测定
食品中黄曲霉毒素的测定方法主要有以下几种：
1. 同位素稀释液相色谱-串联质谱法（ID-LC-MS/MS法）：该方法是目前测定食品中黄曲霉毒素的主要方法之一，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。
该方法使用同位素稀释液对样品进行稀释，然后通过液相色谱-串联质谱法进行分离和检测。
2. 高效液相色谱-柱前衍生法（HPLC-FLD法）：该方法是一种传统的测定方法，具有操作简便、成本低等优点。
该方法使用高效液相色谱进行分离，然后通过柱前衍生法进行检测。
3. 气相色谱-质谱法（GC-MS法）：该方法也是一种常用的测定方法，具有灵敏度高、准确性高等优点。
该方法使用气相色谱进行分离，然后通过质谱法进行检测。
4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）法：该方法是一种快速、简便、经济的测定方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点。
该方法使用特异性抗体进行检测。
以上是常见的几种食品中黄曲霉毒素的测定方法，具体选择哪种方法需要根据实际情况进行考虑。
食品中黄曲霉毒素检测方法概述
食品中黄曲霉毒素检测方法概述黄曲霉毒素是一类由黄曲霉属真菌产生的毒素，主要存在于谷物、豆类、坚果、油料和食品中。
长期摄入含有黄曲霉毒素的食物可能会引发急性和慢性中毒，对人类健康造成威胁。
黄曲霉毒素的检测对于食品安全至关重要。
目前常用的黄曲霉毒素检测方法主要包括物理方法、生化方法和分析化学方法。
物理方法是通过观察和检测食品样品的形态、色泽、气味、质地等特征来判断是否受到黄曲霉毒素的污染。
将食品样品放在光线下检查，如果有蓝绿色或黄绿色荧光发射，可能是受到黄曲霉毒素的污染。
这种方法简单直观，但仅能作为初步判断的依据，并不能准确确定黄曲霉毒素的含量。
生化方法是通过测定黄曲霉毒素对生物体的毒害作用来检测其含量。
常用的生化方法包括了酶联免疫吸附测定法（ELISA）和生物体模型法。
ELISA是一种基于免疫学原理的快速测定方法，通过特异性抗体与黄曲霉毒素结合，形成复合物后再用底物进行发色反应测定。
生物体模型法通过使用实验动物模型（如小鼠、大鼠）来检测黄曲霉毒素的毒性。
这些方法可以较快地获得黄曲霉毒素的含量，但需要专业实验室设备和技术人员进行操作，且对样品处理和操作过程要求较高。
分析化学方法是通过分析食品中的化学成分来检测黄曲霉毒素的含量。
常用的分析化学方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）等。
这些方法通过分离、纯化和定量检测样品中的黄曲霉毒素，在不同波长下检测其吸收峰或特定的质谱峰，并根据标准曲线计算出黄曲霉毒素的含量。
这些方法具有高灵敏度、高选择性和准确性，但需要复杂的仪器设备和专业的分析人员进行操作，且分析过程比较繁琐。
食品中黄曲霉毒素的检测可以通过物理方法、生化方法和分析化学方法来进行。
不同的方法各有优缺点，综合使用多种方法可以提高检测的准确性和可靠性。
为了确保食品安全，对于潜在有黄曲霉毒素污染食品的食品加工企业和消费者，应严格控制食品原料采购、储存和加工环节，以及加强黄曲霉毒素的检测与监测工作。
食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定
食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定1范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1㊁黄曲霉毒素B2㊁黄曲霉毒素G1㊁黄曲霉毒素G2(以下简称A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1和A F T G2)的测定方法㊂本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F TB1㊁A F TB2㊁A F TG1和A F TG2的测定㊂本标准第二法为高效液相色谱-柱前衍生法,适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F T B1㊁A F T B2㊁A F T G1和A F T G2的测定㊂本标准第三法为高效液相色谱-柱后衍生法,适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F T B1㊁A F T B2㊁A F T G1和A F T G2的测定㊂本标准第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品㊁婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中A F TB1的测定㊂本标准第五法为薄层色谱法,适用于谷物及其制品㊁豆类及其制品㊁坚果及籽类㊁油脂及其制品㊁调味品中A F TB1的测定㊂第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法2原理试样中的黄曲霉毒素B1㊁黄曲霉毒素B2㊁黄曲霉毒素G1㊁黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取,提取液用含1%T r i t o nX-100(或吐温-20)的磷酸盐缓冲溶液稀释后(必要时经黄曲霉毒素固相净化柱初步净化),通过免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩㊁定容和过滤后经液相色谱分离,串联质谱检测,同位素内标法定量㊂3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂3.1试剂3.1.1乙腈(C H3C N):色谱纯㊂3.1.2甲醇(C H3O H):色谱纯㊂3.1.3乙酸铵(C H3C O O N H4):色谱纯㊂3.1.4氯化钠(N a C l)㊂3.1.5磷酸氢二钠(N a2H P O4)㊂3.1.6磷酸二氢钾(K H2P O4)㊂3.1.7氯化钾(K C l)㊂3.1.8盐酸(H C l)㊂3.1.9 T r i t o nX-100[C14H22O(C2H4O)n](或吐温-20,C58H114O26)㊂3.2试剂配制3.2.1乙酸铵溶液(5mm o l/L):称取0.39g乙酸铵,用水溶解后稀释至1000m L,混匀㊂3.2.2乙腈-水溶液(84+16):取840m L乙腈加入160m L水,混匀㊂3.2.3甲醇-水溶液(70+30):取700m L甲醇加入300m L水,混匀㊂3.2.4乙腈-水溶液(50+50):取50m L乙腈加入50m L水,混匀㊂3.2.5乙腈-甲醇溶液(50+50):取50m L乙腈加入50m L甲醇,混匀㊂3.2.610%盐酸溶液:取1m L盐酸,用纯水稀释至10m L,混匀㊂3.2.7磷酸盐缓冲溶液(以下简称P B S):称取8.00g氯化钠㊁1.20g磷酸氢二钠(或2.92g十二水磷酸氢二钠)㊁0.20g磷酸二氢钾㊁0.20g氯化钾,用900m L水溶解,用盐酸调节p H至7.4ʃ0.1,加水稀释至1000m L㊂3.2.81%T r i t o nX-100(或吐温-20)的P B S:取10m LT r i t o nX-100(或吐温-20),用P B S稀释至1000m L㊂3.3标准品3.3.1 A F TB1标准品(C17H12O6,C A S:1162-65-8):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂3.3.2 A F TB2标准品(C17H14O6,C A S:7220-81-7):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂3.3.3 A F T G1标准品(C17H12O7,C A S:1165-39-5):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂3.3.4 A F T G2标准品(C17H14O7,C A S:7241-98-7):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂3.3.5同位素内标13C17-A F TB1(C17H12O6,C A S:157449-45-0):纯度ȡ98%,浓度为0.5μg/m L㊂3.3.6同位素内标13C17-A F TB2(C17H14O6,C A S:157470-98-8):纯度ȡ98%,浓度为0.5μg/m L㊂3.3.7同位素内标13C17-A F T G1(C17H12O7,C A S:157444-07-9):纯度ȡ98%,浓度为0.5μg/m L㊂3.3.8同位素内标13C17-A F T G2(C17H14O7,C A S:157462-49-7):纯度ȡ98%,浓度为0.5μg/m L㊂注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液㊂3.4标准溶液配制3.4.1标准储备溶液(10μg/m L):分别称取A F TB1㊁A F TB2㊁A F TG1和A F TG21m g(精确至0.01m g),用乙腈溶解并定容至100m L㊂此溶液浓度约为10μg/m L㊂溶液转移至试剂瓶中后,在-20ħ下避光保存,备用㊂临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)㊂3.4.2混合标准工作液(100n g/m L):准确移取混合标准储备溶液(1.0μg/m L)1.00m L至100m L容量瓶中,乙腈定容㊂此溶液密封后避光-20ħ下保存,三个月有效㊂3.4.3混合同位素内标工作液(100n g/m L):准确移取0.5μg/m L13C17-A F TB1㊁13C17-A F TB2㊁13C17-A F T G1和13C17-A F T G2各2.00m L,用乙腈定容至10m L㊂在-20ħ下避光保存,备用㊂3.4.4标准系列工作溶液:准确移取混合标准工作液(100n g/m L)10μL㊁50μL㊁100μL㊁200μL㊁500μL㊁800μL㊁1000μL至10m L容量瓶中,加入200μL100n g/m L的同位素内标工作液,用初始流动相定容至刻度,配制浓度点为0.1n g/m L㊁0.5n g/m L㊁1.0n g/m L㊁2.0n g/m L㊁5.0n g/m L㊁8.0n g/m L㊁10.0n g/m L的系列标准溶液㊂4仪器和设备4.1匀浆机㊂4.2高速粉碎机㊂4.3组织捣碎机㊂4.4超声波/涡旋振荡器或摇床㊂4.5天平:感量0.01g和0.00001g㊂4.6涡旋混合器㊂4.7高速均质器:转速6500r/m i n~24000r/m i n㊂4.8离心机:转速ȡ6000r/m i n㊂4.9玻璃纤维滤纸:快速㊁高载量㊁液体中颗粒保留1.6μm㊂4.10固相萃取装置(带真空泵)㊂4.11氮吹仪㊂4.12液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源㊂4.13液相色谱柱㊂4.14免疫亲和柱:A F TB1柱容量ȡ200n g,A F TB1柱回收率ȡ80%,A F TG2的交叉反应率ȡ80%(验证方法参见附录B)㊂注:对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证㊂4.15黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱):对复杂基质样品测定时使用㊂4.16微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)㊂4.17筛网:1mm~2mm试验筛孔径㊂4.18p H计㊂5分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品上样㊁淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同,应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作㊂警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行㊂该区域应避光(直射阳光)㊁具备相对独立的操作台和废弃物存放装置㊂在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施㊂5.1样品制备5.1.1液体样品(植物油㊁酱油㊁醋等)采样量需大于1L,对于袋装㊁瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100g(m L)样品进行检测㊂5.1.2固体样品(谷物及其制品㊁坚果及籽类㊁婴幼儿谷类辅助食品等)采样量需大于1k g,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于2mm孔径试验筛,混合均匀后缩分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用㊂5.1.3半流体(腐乳㊁豆豉等)采样量需大于1k g(L),对于袋装㊁瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用㊂5.2样品提取5.2.1液体样品5.2.1.1植物油脂称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入100μL同位素内标工作液(3.4.3)振荡混合后静置30m i n㊂加入20m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n,取上清液备用㊂5.2.1.2酱油㊁醋称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入125μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂用乙腈或甲醇定容至25m L(精确至0.1m L),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂5.2.2固体样品5.2.2.1一般固体样品称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂加入20.0m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂5.2.2.2婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂加入20.0m L乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂5.2.3半流体样品称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置30m i n㊂加入20.0m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂5.3样品净化5.3.1免疫亲和柱净化5.3.1.1上样液的准备准确移取4m L上清液,加入46m L1%T r i t i o nX-100(或吐温-20)的P B S(使用甲醇-水溶液提取时可减半加入),混匀㊂5.3.1.2免疫亲和柱的准备将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温㊂5.3.1.3试样的净化待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液移至50m L注射器筒中,调节下滴速度,控制样液以1m L/m i n~3m L/m i n的速度稳定下滴㊂待样液滴完后,往注射器筒内加入2ˑ10m L水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱㊂待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱㊂脱离真空系统,在亲和柱下部放置10m L刻度试管,取下50m L的注射器筒,加入2ˑ1m L甲醇洗脱亲和柱,控制1m L/m i n~3m L/m i n的速度下滴,再用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至试管中㊂在50ħ下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,加入1.0m L初始流动相,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样㊂5.3.2黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒㊁胡椒和辣椒等复杂基质)5.3.2.1净化柱净化移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液㊂5.3.2.2免疫亲和柱净化用刻度移液管准确吸取上述净化液4m L,加入46m L1%T r i t i o n X-100(或吐温-20)的P B S[使用甲醇-水溶液提取时,加入23m L1%T r i t i o n X-100(或吐温-20)的P B S],混匀㊂按5.3.1.2和5.3.1.3处理㊂注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用㊂5.4液相色谱参考条件液相色谱参考条件列出如下:a)流动相:A相:5mm o l/L乙酸铵溶液;B相:乙腈-甲醇溶液(50+50);b)梯度洗脱:32%B(0m i n~0.5m i n),45%B(3m i n~4m i n),100%B(4.2m i n~4.8m i n),32%B(5.0m i n~7.0m i n);c)色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者;d)流速:0.3m L/m i n;e)柱温:40ħ;f)进样体积:10μL㊂5.5质谱参考条件质谱参考条件列出如下:a)检测方式:多离子反应监测(MR M);b)离子源控制条件:参见表1;c)离子选择参数:参见表2;d)子离子扫描图:参见图C.1~图C.8;e)液相色谱-质谱图:见图C.9㊂表1离子源控制条件电离方式E S I+毛细管电压/k V3.5锥孔电压/V30射频透镜1电压/V14.9射频透镜2电压/V15.1表1(续)离子源温度/ħ150锥孔反吹气流量/(L/h)50脱溶剂气温度/ħ500脱溶剂气流量/(L/h)800电子倍增电压/V650表2离子选择参数表化合物名称母离子(m/z)定量离子(m/z)碰撞能量e V定性离子(m/z)碰撞能量e V离子化方式A F TB13132852224138E S I+13C17-A F TB13302552330135E S I+A F TB23152872525928E S I+13C17-A F TB23323032527328E S I+A F T G13292432528325E S I+13C17-A F T G13462572529925E S I+A F T G23312453028527E S I+13C17-A F T G23482593030127E S I+5.6定性测定试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在ʃ2.5%之内㊂每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差不超过表3规定的范围㊂表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%>5020~5010~20ɤ10允许相对偏差/%ʃ20ʃ25ʃ30ʃ505.7标准曲线的制作在5.4㊁5.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以A F TB1㊁A F TB2㊁A F TG1和A F TG2色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方程,其线性相关系数应大于0.99㊂5.8试样溶液的测定取5.3处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按第6章计算样品中待测物的含量㊂待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应适当减少取样量重新测定㊂5.9空白试验不称取试样,按5.2和5.3的步骤做空白实验㊂应确认不含有干扰待测组分的物质㊂6分析结果的表述试样中A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1和A F T G2的残留量按式(1)计算:X=ρˑV1ˑV3ˑ1000V2ˑmˑ1000 (1)式中:X 试样中A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1或A F T G2的含量,单位为微克每千克(μg/k g);ρ 进样溶液中A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1或A F T G2按照内标法在标准曲线中对应的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V1 试样提取液体积(植物油脂㊁固体㊁半固体按加入的提取液体积;酱油㊁醋按定容总体积),单位为毫升(m L);V3 样品经净化洗脱后的最终定容体积,单位为毫升(m L);1000 换算系数;V2 用于净化分取的样品体积,单位为毫升(m L);m 试样的称样量,单位为克(g)㊂计算结果保留三位有效数字㊂7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%㊂8其他当称取样品5g时,A F TB1的检出限为:0.03μg/k g,A F TB2的检出限为0.03μg/k g,A F TG1的检出限为0.03μg/k g,A F T G2的检出限为0.03μg/k g;A F TB1的定量限为0.1μg/k g,A F TB2的定量限为0.1μg/k g,A F T G1的定量限为0.1μg/k g,A F T G2的定量限为0.1μg/k g㊂第二法高效液相色谱-柱前衍生法9原理试样中的黄曲霉毒素B1㊁黄曲霉毒素B2㊁黄曲霉毒素G1㊁黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液经黄曲霉毒素固相净化柱净化去除脂肪㊁蛋白质㊁色素及碳水化合物等干扰物质,净化液用三氟乙酸柱前衍生,液相色谱分离,荧光检测器检测,外标法定量㊂10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂10.1试剂10.1.1甲醇(C H3O H):色谱纯㊂10.1.2乙腈(C H3C N):色谱纯㊂10.1.3正己烷(C6H14):色谱纯㊂10.1.4三氟乙酸(C F3C O O H)㊂10.2试剂配制10.2.1乙腈-水溶液(84+16):取840m L乙腈加入160m L水㊂10.2.2甲醇-水溶液(70+30):取700m L甲醇加入300m L水㊂10.2.3乙腈-水溶液(50+50):取500m L乙腈加入500m L水㊂10.2.4乙腈-甲醇溶液(50+50):取500m L乙腈加入500m L甲醇㊂10.3标准品10.3.1 A F TB1标准品(C17H12O6,C A S号:1162-65-8):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂10.3.2 A F TB2标准品(C17H14O6,C A S号:7220-81-7):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂10.3.3 A F T G1标准品(C17H12O7,C A S号:1165-39-5):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂10.3.4 A F T G2标准品(C17H14O7,C A S号:7241-98-7):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液㊂10.4标准溶液配制10.4.1标准储备溶液(10μg/m L):分别称取A F T B1㊁A F T B2㊁A F T G1和A F T G21m g(精确至0.01m g),用乙腈溶解并定容至100m L㊂此溶液浓度约为10μg/m L㊂溶液转移至试剂瓶中后,在-20ħ下避光保存,备用㊂临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)㊂10.4.2混合标准工作液(A F TB1和A F T G1:100n g/m L,A F TB2和A F T G2:30n g/m L):准确移取A F TB1和A F T G1标准储备溶液各1m L,A F TB2和A F T G2标准储备溶液各300μL至100m L容量瓶中,乙腈定容㊂密封后避光-20ħ下保存,三个月内有效㊂10.4.3标准系列工作溶液:分别准确移取混合标准工作液10μL㊁50μL㊁200μL㊁500μL㊁1000μL㊁2000μL㊁4000μL至10m L容量瓶中,用初始流动相定容至刻度(含A F T B1和A F T G1浓度为0.1n g/m L㊁0.5n g/m L㊁2.0n g/m L㊁5.0n g/m L㊁10.0n g/m L㊁20.0n g/m L㊁40.0n g/m L,A F T B2和A F T G2浓度为0.03n g/m L㊁0.15n g/m L㊁0.6n g/m L㊁1.5n g/m L㊁3.0n g/m L㊁6.0n g/m L㊁12n g/m L 的系列标准溶液)㊂11仪器和设备11.1匀浆机㊂11.2高速粉碎机㊂11.3组织捣碎机㊂11.4超声波/涡旋振荡器或摇床㊂11.5天平:感量0.01g和0.00001g㊂11.6涡旋混合器㊂11.7高速均质器:转速6500r/m i n~24000r/m i n㊂11.8离心机:转速ȡ6000r/m i n㊂11.9玻璃纤维滤纸:快速㊁高载量㊁液体中颗粒保留1.6μm㊂11.10氮吹仪㊂11.11液相色谱仪:配荧光检测器㊂11.12色谱分离柱㊂11.13黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱(以下简称净化柱),或相当者㊂11.14一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)㊂11.15筛网:1mm~2mm试验筛孔径㊂11.16恒温箱㊂11.17p H计㊂12分析步骤12.1样品制备12.1.1液体样品(植物油㊁酱油㊁醋等)采样量需大于1L,对于袋装㊁瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100g(m L)样品进行检测㊂12.1.2固体样品(谷物及其制品㊁坚果及籽类㊁婴幼儿谷类辅助食品等)采样量需大于1k g,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于2mm孔径试验筛,混合均匀后缩分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用㊂12.1.3半流体(腐乳㊁豆豉等)采样量需大于1k g(L),对于袋装㊁瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用㊂12.2样品提取12.2.1液体样品12.2.1.1植物油脂称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入20m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n,取上清液备用㊂12.2.1.2酱油㊁醋称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,用乙腈或甲醇定容至25m L(精确至0.1m L),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂12.2.2固体样品12.2.2.1一般固体样品称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入20.0m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂12.2.2.2婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入20.0m L乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂12.2.3半流体样品称取5g试样(精确至0.01g)于50m L离心管中,加入20.0m L乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20m i n(或用均质器均质3m i n),在6000r/m i n下离心10m i n(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用㊂12.3样品黄曲霉毒素固相净化柱净化移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液㊂12.4衍生用移液管准确吸取4.0m L净化液于10m L离心管后在50ħ下用氮气缓缓地吹至近干,分别加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸,涡旋30s,在40ħʃ1ħ的恒温箱中衍生15m i n,衍生结束后,在50ħ下用氮气缓缓地将衍生液吹至近干,用初始流动相定容至1.0m L,涡旋30s溶解残留物,过0.22μm滤膜,收集滤液于进样瓶中以备进样㊂12.5色谱参考条件色谱参考条件列出如下:a)流动相:A相:水,B相:乙腈-甲醇溶液(50+50);b)梯度洗脱:24%B(0m i n~6m i n),35%B(8.0m i n~10.0m i n),100%B(10.2m i n~11.2m i n),24%B(11.5m i n~13.0m i n);c)色谱柱:C18柱(柱长150mm或250mm,柱内径4.6mm,填料粒径5.0μm),或相当者;d)流速:1.0m L/m i n;e)柱温:40ħ;f)进样体积:50μL;g)检测波长:激发波长360n m;发射波长440n m;h)液相色谱图:参见图D.1㊂12.6样品测定12.6.1标准曲线的制作系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测,以峰面积为纵坐标-浓度为横坐标作图,得到标准曲线回归方程㊂12.6.2试样溶液的测定待测样液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内,浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进样分析㊂12.6.3空白试验不称取试样,按12.2㊁12.3和12.4的步骤做空白实验㊂应确认不含有干扰待测组分的物质㊂13分析结果的表述试样中A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1和A F T G2的残留量按式(2)计算:X=ρˑV1ˑV3ˑ1000V2ˑmˑ1000 (2)式中:X 试样中A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1或A F T G2的含量,单位为微克每千克(μg/k g);ρ 进样溶液中A F TB1㊁A F TB2㊁A F T G1或A F T G2按照外标法在标准曲线中对应的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V1 试样提取液体积(植物油脂㊁固体㊁半固体按加入的提取液体积;酱油㊁醋按定容总体积),单位为毫升(m L);V3 净化液的最终定容体积,单位为毫升(m L);1000 换算系数;V2 净化柱净化后的取样液体积,单位为毫升(m L);m 试样的称样量,单位为克(g)㊂计算结果保留三位有效数字㊂14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%㊂15其他当称取样品5g时,柱前衍生法的A F TB1的检出限为0.03μg/k g,A F TB2的检出限为0.03μg/k g, A F TG1的检出限为0.03μg/k g,A F TG2的检出限为0.03μg/k g;柱前衍生法的A F TB1的定量限为0.1μg/ k g,A F TB2的定量限为0.1μg/k g,A F TG1的定量限为0.1μg/k g,A F TG2的定量限为0.1μg/k g㊂第三法高效液相色谱-柱后衍生法导语:下述方法的仪器检测部分,包括碘或溴试剂衍生㊁光化学衍生㊁电化学衍生等柱后衍生方法,可根据实际情况,选择其中一种方法即可㊂16原理试样中的黄曲霉毒素B1㊁黄曲霉毒素B2㊁黄曲霉毒素G1㊁黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液经免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩㊁定容和过滤后经液相色谱分离,柱后衍生(碘或溴试剂衍生㊁光化学衍生㊁电化学衍生等),经荧光检测器检测,外标法定量㊂17试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂17.1试剂17.1.1甲醇(C H3O H):色谱纯㊂17.1.2乙腈(C H3C N):色谱纯㊂17.1.3氯化钠(N a C l)㊂17.1.4磷酸氢二钠(N a2H P O4)㊂17.1.5磷酸二氢钾(K H2P O4)㊂17.1.6氯化钾(K C l)㊂17.1.7盐酸(H C l)㊂17.1.8 T r i t o nX-100[C14H22O(C2H4O)n](或吐温-20,C58H114O26)㊂17.1.9碘衍生使用试剂:碘(I2)㊂17.1.10溴衍生使用试剂:三溴化吡啶(C5H6B r3N2)㊂17.1.11电化学衍生使用试剂:溴化钾(K B r)㊁浓硝酸(HN O3)㊂17.2试剂配制17.2.1乙腈-水溶液(84+16):取840m L乙腈加入160m L水㊂17.2.2甲醇-水溶液(70+30):取700m L甲醇加入300m L水㊂17.2.3乙腈-水溶液(50+50):取500m L乙腈加入500m L水㊂17.2.4乙腈-水溶液(10+90):取100m L乙腈加入900m L水㊂17.2.5乙腈-甲醇溶液(50+50):取500m L乙腈加入500m L甲醇㊂17.2.6磷酸盐缓冲溶液(以下简称P B S):称取8.00g氯化钠㊁1.20g磷酸氢二钠(或2.92g十二水磷酸氢二钠)㊁0.20g磷酸二氢钾㊁0.20g氯化钾,用900m L水溶解,用盐酸调节p H至7.4,用水定容至1000m L㊂17.2.71%T r i t o nX-100(或吐温-20)的P B S:取10m LT r i t o nX-100,用P B S定容至1000m L㊂17.2.80.05%碘溶液:称取0.1g碘,用20m L甲醇溶解,加水定容至200m L,用0.45μm的滤膜过滤,现配现用(仅碘柱后衍生法使用)㊂17.2.95m g/L三溴化吡啶水溶液:称取5m g三溴化吡啶溶于1L水中,用0.45μm的滤膜过滤,现配现用(仅溴柱后衍生法使用)㊂17.3标准品17.3.1 A F TB1标准品(C17H12O6,C A S号:1162-65-8):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂17.3.2 A F TB2标准品(C17H14O6,C A S号:7220-81-7):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂17.3.3 A F T G1标准品(C17H12O7,C A S号:1165-39-5):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂17.3.4 A F T G2标准品C17H14O7,C A S号:7241-98-7):纯度ȡ98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质㊂注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液㊂17.4标准溶液配制17.4.1标准储备溶液(10μg/m L):分别称取A F T B1㊁A F T B2㊁A F T G1和A F T G21m g(精确至0.01m g),用乙腈溶解并定容至100m L㊂此溶液浓度约为10μg/m L㊂溶液转移至试剂瓶中后,在-20ħ下避光保存,备用㊂临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)㊂17.4.2混合标准工作液(A F TB1和A F T G1:100n g/m L,A F TB2和A F T G2:30n g/m L):准确移取A F TB1和A F T G1标准储备溶液各1m L,A F TB2和A F T G2标准储备溶液各300μL至100m L容量瓶中,乙腈定容㊂密封后避光-20ħ下保存,三个月内有效㊂17.4.3标准系列工作溶液:分别准确移取混合标准工作液10μL㊁50μL㊁200μL㊁500μL㊁1000μL㊁2000μL㊁4000μL至10m L容量瓶中,用初始流动相定容至刻度(含A F T B1和A F T G1浓度为0.1n g/m L㊁0.5n g/m L㊁2.0n g/m L㊁5.0n g/m L㊁10.0n g/m L㊁20.0n g/m L㊁40.0n g/m L,A F T B2和A F T G2浓度为0.03n g/m L㊁0.15n g/m L㊁0.6n g/m L㊁1.5n g/m L㊁3.0n g/m L㊁6.0n g/m L㊁12n g/m L 的系列标准溶液)㊂18仪器和设备18.1匀浆机㊂18.2高速粉碎机㊂18.3组织捣碎机㊂18.4超声波/涡旋振荡器或摇床㊂18.5天平:感量0.01g和0.00001g㊂18.6涡旋混合器㊂18.7高速均质器:转速6500r/m i n~24000r/m i n㊂18.8离心机:转速ȡ6000r/m i n㊂18.9玻璃纤维滤纸:快速㊁高载量㊁液体中颗粒保留1.6μm㊂18.10固相萃取装置(带真空泵)㊂18.11氮吹仪㊂18.12液相色谱仪:配荧光检测器(带一般体积流动池或者大体积流通池)㊂注:当带大体积流通池时不需要再使用任何型号或任何方式的柱后衍生器㊂18.13液相色谱柱㊂18.14光化学柱后衍生器(适用于光化学柱后衍生法)㊂18.15溶剂柱后衍生装置(适用于碘或溴试剂衍生法)㊂18.16电化学柱后衍生器(适用于电化学柱后衍生法)㊂18.17免疫亲和柱:A F TB1柱容量ȡ200n g,A F TB1柱回收率ȡ80%,A F T G2的交叉反应率ȡ80% (验证方法参见附录B)㊂注:对于每个批次的亲和柱使用前需质量验证㊂18.18黄曲霉毒素固相净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱):对复杂基质样品测定时使用㊂18.19一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)㊂18.20筛网:1mm~2mm试验筛孔径㊂19分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品的上样㊁淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作㊂警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行㊂该区域应避光(直射阳光)㊁具备相对独立的操作台和废弃物存放装置㊂在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施㊂19.1样品制备同12.1㊂19.2样品提取同12.2㊂19.3样品净化19.3.1免疫亲和柱净化19.3.1.1上样液的准备准确移取4m L上述上清液,加入46m L1%T r i t o nX-100(或吐温-20)的P B S(使用甲醇-水溶液提取时可减半加入),混匀㊂19.3.1.2免疫亲和柱的准备将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温㊂19.3.1.3试样的净化免疫亲和柱内的液体放弃后,将上述样液移至50m L注射器筒中,调节下滴速度,控制样液以1m L/m i n~3m L/m i n的速度稳定下滴㊂待样液滴完后,往注射器筒内加入2ˑ10m L水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱㊂待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱㊂脱离真空系统,在亲和柱下部放置10m L刻度试管,取下50m L的注射器筒,2ˑ1m L甲醇洗脱亲和柱,控制1m L/m i n~3m L/m i n的速度下滴,再用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至试管中㊂在50ħ下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,用初始流动相定容至1.0m L,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样㊂19.3.2黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒㊁胡椒和辣椒等复杂基质)19.3.2.1净化柱净化移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液㊂19.3.2.2免疫亲和柱净化用刻度移液管准确吸取上部净化液4m L,加入46m L1%T r i t o nX-100(或吐温-20)的P B S(使用甲醇-水溶液提取时可减半加入),混匀㊂按19.4.1.3处理㊂注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用㊂19.4液相色谱参考条件19.4.1无衍生器法(大流通池直接检测)液相色谱参考条件列出如下:a)流动相:A相,水;B相,乙腈-甲醇(50+50);b)等梯度洗脱条件:A,65%;B,35%;。
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3.1．薄层层析法
薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为 AOAC(association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析 黄曲霉毒素的功能。
④黄曲霉毒素B：标准使用液：
I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混 合液稀释、定容。
Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。
Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。
⑤次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业 用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含 次氯酸25g／L。污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。
第一点：10μL AFTB，标准使用液(0．04μg／mL)。
第二点：20μL样液。第三点：20μL样液+10μL 0.04μg／mL AFTBl标准使用液。第 四点：20μL样液+10μL 0.02tLg，／m L AFTB。标准使用液。
②展开与观察 在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一 展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察
3.1.3操作步骤
(1)样品处理
样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至0．5～lkg后全部粉碎。粮 食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。
(2)提取
称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油 醚和100mL甲醇水清液，瓶塞上涂一层水、盖严防漏。振荡30min，静置片刻， 以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后， 放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液(相当于4.0g样 品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如 出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先 用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加 5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中， 最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜， 于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯一乙 腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出， 将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上
a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠。 若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中AFTB1最低 检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标 准为0．002ug．主要起定位作用。
②硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇 水溶液(55+45)。
③黄曲霉毒素B1标准液：准确称取1～1．2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再 用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光 光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10．0ug／mL。在350nm， AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800 .
3.1.1 原理
本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波 长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉 毒素B1的含量。
薄层色谱法黄曲霉毒素Bt的最低检出量为0．000 4ug，最低检出浓度为5ug／Kg。
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3.1.2 仪器和试剂
食品中黄曲霉毒素测定
黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种，包括B1、 B2、Gl、G2、Ml、M2、Pl、Q、H1、GM、B2。和毒醇。黄曲霉毒素的基本结构为二呋 喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧 杂萘邻酮(香豆素)。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在 体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子型式含B1、B2、G1、G2、 M1、M2等。其中M1和M2主要存在于牛奶中。B1为毒性及致癌性最强的物质。在紫外 线下，黄曲霉毒素B1、B2发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉毒素 的相对分子量为312～346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂， 但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍 有分解。
(3)测定
①单向展开法
a．薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒人 涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在 100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可 再活化后使用。
b．点样：将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量 注射器或血红素吸管滴加样液。一块பைடு நூலகம்可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm， 点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸 边加。滴加样式如下：
(1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板5cm×20cm、薄层板涂 布器、展开槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器 (2)试剂
①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无水乙 醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定 即可使用，否则需逐一进行重蒸。