免疫共沉淀——研究蛋白质间相互作用的技术
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4)
8)通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带
9)从胶上切下目标带，将其放到微量离心管
中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min 10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电 洗脱 11)通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的 肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman 降解测序。
2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使
用。 3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单 抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG
4 应用
通常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结
合产生相互作用。 用于验证确定某种特定蛋白质的新的作用搭 档。
5 优点
1） Co-IP是检测蛋白质间相互作用的经典方
2）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质—
蛋白质相互作用。
3）不能给出动态的结果，同时也还应该排除
细胞在破碎时导致本来没有相互作用的蛋白 质发生凝聚的可能性
4）所得的蛋白质有可能不是直接相互作用的
蛋白质,而是通过第三者间接相互作用的蛋白 质
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
利用免疫共沉淀（CO-IP）技术、酶联免疫
免疫共沉淀（Co-IP ）
—ຫໍສະໝຸດ Baidu研究蛋白质间相互作用的技术
05级生化专业：毛赟赟
蛋白质相互作用的类型有牢固型互作和暂时型互作 两种。互作力既可以强，也可以弱。 牢固型互作以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免 疫共沉淀（Co-immunoprecipitatio）、Pull-down 或Far-western法研究。 暂时型蛋白质相互作用，被认为是涉及到胞内大部 分生物过程，包括蛋白修饰、转运、折叠、信号转 导和细胞周期等，属于开/闭性质，可以通过交联或 标记转移法来研究。胞内研究蛋白质互作的方法除 上述方法外，还有蛋白芯片、核磁共振、质谱、X射线晶体衍射等 。
法，在此方法中,蛋白质及复合物均以天然状 态存在，符合体内实际情况，能更真实的反 映出蛋白质间的相互作用情况，得到的蛋白 可信度高 2）抗原与相互作用的蛋白质以细胞中相类似 的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白质所造 成的人为效应。
6 局限性
1）此方法本身具有一定的风险,因为所选择靶
蛋白的相关蛋白在此细胞株中可能没有明显差 异这就需要实验前做好充分的准备,并根据亚 系间不同的生物学行为来正确的选择靶蛋白
（ELISA）都可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的 环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而 在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以 通过酵母双杂交进行检测，从而在活细胞的 水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3 注意的问题
1）细胞裂解
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在 的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非 离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细 胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞 裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min
2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，
3)收集上清（约30
ml）并加入30μg的适当抗 体，4℃摇动免疫沉淀物1 h
加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液， 4℃摇动免疫沉淀物30 min 5)用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白ASepharose混合物，再重复洗5次。最后，用 NETN洗一次 6)吸出混合物的液体部分。加入800μl的 1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min 7)将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯 度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜
1 Co-IP的原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质—蛋白质间的 相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合 的蛋白质Y也能沉淀下来。
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
2
1)
方法
收获培养的细胞（1×107－1×108）冷 PBS洗涤2次细胞裂解液裂解细胞，冰浴 30min
8)通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带
9)从胶上切下目标带，将其放到微量离心管
中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min 10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电 洗脱 11)通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的 肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman 降解测序。
2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使
用。 3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单 抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG
4 应用
通常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结
合产生相互作用。 用于验证确定某种特定蛋白质的新的作用搭 档。
5 优点
1） Co-IP是检测蛋白质间相互作用的经典方
2）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质—
蛋白质相互作用。
3）不能给出动态的结果，同时也还应该排除
细胞在破碎时导致本来没有相互作用的蛋白 质发生凝聚的可能性
4）所得的蛋白质有可能不是直接相互作用的
蛋白质,而是通过第三者间接相互作用的蛋白 质
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
利用免疫共沉淀（CO-IP）技术、酶联免疫
免疫共沉淀（Co-IP ）
—ຫໍສະໝຸດ Baidu研究蛋白质间相互作用的技术
05级生化专业：毛赟赟
蛋白质相互作用的类型有牢固型互作和暂时型互作 两种。互作力既可以强，也可以弱。 牢固型互作以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免 疫共沉淀（Co-immunoprecipitatio）、Pull-down 或Far-western法研究。 暂时型蛋白质相互作用，被认为是涉及到胞内大部 分生物过程，包括蛋白修饰、转运、折叠、信号转 导和细胞周期等，属于开/闭性质，可以通过交联或 标记转移法来研究。胞内研究蛋白质互作的方法除 上述方法外，还有蛋白芯片、核磁共振、质谱、X射线晶体衍射等 。
法，在此方法中,蛋白质及复合物均以天然状 态存在，符合体内实际情况，能更真实的反 映出蛋白质间的相互作用情况，得到的蛋白 可信度高 2）抗原与相互作用的蛋白质以细胞中相类似 的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白质所造 成的人为效应。
6 局限性
1）此方法本身具有一定的风险,因为所选择靶
蛋白的相关蛋白在此细胞株中可能没有明显差 异这就需要实验前做好充分的准备,并根据亚 系间不同的生物学行为来正确的选择靶蛋白
（ELISA）都可以研究抗原和抗体之间的相 互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的 环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而 在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以 通过酵母双杂交进行检测，从而在活细胞的 水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3 注意的问题
1）细胞裂解
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在 的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非 离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细 胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞 裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min
2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，
3)收集上清（约30
ml）并加入30μg的适当抗 体，4℃摇动免疫沉淀物1 h
加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液， 4℃摇动免疫沉淀物30 min 5)用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白ASepharose混合物，再重复洗5次。最后，用 NETN洗一次 6)吸出混合物的液体部分。加入800μl的 1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min 7)将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯 度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜
1 Co-IP的原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质—蛋白质间的 相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合 的蛋白质Y也能沉淀下来。
免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题
2
1)
方法
收获培养的细胞（1×107－1×108）冷 PBS洗涤2次细胞裂解液裂解细胞，冰浴 30min