牛病毒性腹泻与粘膜病

核酸探针检测（NAH）
与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而 且应用很广泛，NAH 可直接检测脏器组织和血细胞 中的 BVDV。NAH 技术应用最广泛的是核酸标记法 ，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射 性同位素（如 32P，35S）标记的 DNA 探针，另一 类是用如地高辛、生物素标记的 DNA 探针。核酸 探针技术标记简单，特异性好，可长期保存，并且 可以回收利用，制成试剂盒，是一种安全、快速、 经济的诊断方法。
免疫过氧化物酶技术（IP）
免疫过氧化物酶技术 （IP）诊断 BVDV 准确、 可靠，可用于了解 BVD 近年来，为了避 免非特异性染色反 应，则可以使用单 克隆抗体+生物素化 抗鼠抗体-链酶亲和 素过氧化物酶检测 方法。
的总体分布情况。链酶亲
和素-生物素过氧化物酶
检测方法，可以用来检测
福尔马林固定、石蜡包埋
预防和控制
• 免疫预防和药物治疗
• 健全完善 BVD 检测体系，加强检测牛群及
牛源生物制品的 BVDV 污染情况
• 排除掉持续性感染牛等隐性感染动物
• 加强环境监控，在饲养环节加强管理，建 立封闭式牧场管理系统，不进行混合饲养 • 实施免疫预防、过度到捕杀根除程序
NS3
E2பைடு நூலகம்
与抗BVDV抗体结合、 介导免疫中和反应及 与宿主细胞识别、吸 附的主要部位
Npro
具有自体蛋白酶活性， 有较高的保守，可以对 瘟病毒进行种、群或型 的鉴定
5'-UTR：5'末端无甲基化的“帽子”结构，5'UTR序列在BVDV的各毒株间有较高的保守性，因 此常根据5'-UTR的序列设计引物来检测 BVDV或 对 BVDV 进行分型。5'-UTR 在病毒转录、翻译 过程中起重要的作用。 2010年张兴娟等分别用5'-UTR设计一对引物， 预扩增片段125bp；2010年孟雨等人也利用5'UTR设计一对引物，预扩增片段218bp，实验证明
诊断方法的进展
1
血清学诊断 免疫学诊断 分子生物学诊断
2
3
血清学诊断
常见的方法为主要包括血清中和试验 和琼脂扩散试验两种。 琼脂扩散试验准确性较低，检出的结果 常常有假阳性。 血清中和试验重复性高，准确性好，已作 为 BVDV 诊断的“金标准”，但血清中和试 验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要 细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广
性率为19.56%，近年来本病在国内阳性检出率呈逐年上
涨的趋势。本病给养牛业造成明显损失（产乳↓、重↓
、流产等）。
内容摘要
1 2
BVDV的流行病学 BVDV的病原学
3 BVDV的基因结构及其蛋白 4 5
BVDV的研究进展 BVDV的主要诊断方法 BVDV的防治
6
BVDV的流行病学
传 染 源：病牛和带毒牛是主要传染源。 传播途径：主要通过消化道和呼吸道传播；直接或 间接接触也可以传播；吸血昆虫也是重要的传播 媒介。 易感动物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染 猪。 本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病发 生。
组织切片中的BVDV。
分子生物学诊断
1
2
RT-PCR
核酸探针检测
RT-PCR
RT–PCR 是目前广泛应用的分
子生物学技术，对于检测 BVDV 的
RNA 是一个合适的方法。根据 BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性 引物，可以高度特异、敏感的检测 出器官、组织、细胞培养物中的
BVDV，并可区别 CSFV、BDV，还可
免疫学诊断
免疫荧光技 术（IFA） 酶联免疫吸 免疫过氧化 附试验 （ELISA） 物酶技术
（IP）
免疫荧光技术（IFA）
免疫荧光技术（IFA）又称荧光抗体技 术，可用于检测细胞培养物以及病变组织 的冰冻切片中 BVDV 感染情况。 免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速， 但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得 到推广应用。
BVDV的病原学
• 属黄病毒科、瘟病毒属
• 有囊膜，直径25-30nm，正链RNA
• 胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖 传代 BVDV。BVDV 可以分成致细胞病变 型（CP）和非致细胞病变型（NCP）。
BVDV的基因结构及其蛋白
5'-Npro（P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)E2(gp53)-P7- NS2-3 (P125)-NS4A (P10)- NS4B (P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3',其中C，ERNS， E1，E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白。
利用5'-UTR设计引物具有很好的特异性和敏感性。
E2：是BVDV的主要保护性抗原，能诱导机体产生中
和抗体，所以新型疫苗都是针对E2结构蛋白的。也是 与抗 BVDV 抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细 胞识别、吸附的主要部位，E2 基因一直是国内外学者 研究瘟病毒的重点。
E2 是形成 BVD 基因工程疫苗的最好的选择。
BVDV E2 DNA 疫苗是近年来 BVDV 免疫研究的热点。
如2007吴明福等构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-E2
并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞 免疫应答。
NS-3：NS3区域与病毒的毒力，生长特性有
关。NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、
病毒RNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具 有重要作用。NS3的表达与宿主细胞CPE的产生 有密切关系。 2009年魏伟等用BVDV NS3 蛋白中有免疫反 应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个 BVDV 抗体检测的间接 ELISA 方法。
BVDV的主要基因、蛋白研究进展
核衣壳组成 成分，具有 免疫原性 BVDV 基因组 具有较高的保 守性
C
内有一高度保 守结构域，可 用于研究亚单 位疫苗，也可 作为基因工程 诊断抗原
5‘-UTR
瘟病毒属内高度 保守，在病毒复 制、病毒RNA转 译或者病毒多聚 蛋白加工过程中 具有重要作用
ERNS
ADD YOUR TITLE
酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA ELISA 常被用于检测组织器官培养物中
BVDV，监测牛群中 BVD 抗体水平，评估潜伏
感染情况。其中最常用的是双抗夹心 ELISA 和间接 ELISA，也有使用 BVDV 单克隆抗体与 ELISA 联合诊断 BVD。 研究较多的IBRV诊断蛋白有NS3，E2蛋白
牛病毒性腹泻与黏膜病
牛病毒性腹泻
牛病毒性腹泻，又称牛病毒性腹泻/粘膜病，是由 BVDV引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及
猪的一种重要传染病。临床主要表现为发热、粘膜糜烂
、溃疡、白细胞减少、持续感染、咳嗽及怀孕母牛流产 或产生畸形胎儿。同一种病原引起的多种病状的传染病 我国1980年李佑民首从国外进口奶牛分离出BVDV； 上世纪90年代郑志刚等在全国范围内调查，BVDV平均阳
对 BVDV 的基因型和生物型作进一 步的鉴定
PCR引物多数选在BVDV保守区5’-UTR 和NS3基因内，尤其5’UTR是BVDV进行鉴定 、基因分型的首选区域。 2007年王伟利建立了 BVDV 荧光 RTPCR 检测方法并进行了初步应用，2007年 国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性 腹泻/黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程