基于反向分子对接技术土贝母皂苷甲抗肿瘤机制研究-史海龙

124第18卷 第7期 2016 年 7 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 18 No. 7 Jul .，2016中草药在肿瘤疾病的预防和治疗中因其不易产生耐受性并且副作用小等优点，备受国人关注，在抑制肿瘤细胞增殖中起着重要的作用。

土贝母为葫芦科植物，是一种广泛应用的传统中药[1]，草本植物，攀援性蔓生，早在元清时期就在中国被广泛用于治疗蛇毒、炎症等顽疾，以清代医学家赵学敏撰写《本草纲目拾遗》为证[2]。

野生土贝母广泛分布，并可大量人工种植，主产地在陕西、甘肃、四川、云南、山东、山西、河南、河北、内蒙古等地。

土贝母的药用部位是块茎，块茎经干燥后其质地坚硬，可长期保存其药用价值。

王永清课题组于1981年[3]首次在国际刊物发表文章，证实了土贝母皂苷提取物具有明显的抗肿瘤作用；又经历10年深入研究，于1991年该课题组发现土贝母皂苷甲强烈地抑制小鼠耳炎性水肿及皮肤促癌过程，并且可对激癌剂激活、促癌剂诱导的皮肤肿瘤的发生产生彻底的抑制作用，皮肤局部用药或口服也具有很好的疗效[4]。

自此土贝母皂苷被发现具有较强的抗肿瘤作用后受到广泛的关注，并从中分离提取出的土贝母皂苷甲也更引起众多科研机构的深入研究。

目前，已有体外细胞学实验数据证明，土贝母皂苷甲能有效抑制多种癌细胞增殖，包括人鼻咽癌细胞株（CNE-2Z）[5]、胃癌细胞株（BCG823）[6]、人子宫颈癌细胞株（Helacells）[7]、人白血病细胞株（HL60）[8]、人卵巢癌细胞株（SKOV3）[9]和人肝癌细胞株（HepG2）[10]等癌细胞。

尽管上述实验研究表明对土贝母皂苷甲的抗肿瘤机制，科学家们已经有了初步的认识，然而研究方法大多仍局限于体外细胞培养水平，土贝母皂苷甲有可能是一种新的抗癌药物成分，但是其针对癌细胞的作用靶点知之甚少，也无法深入研究抗肿瘤分子机制。

Fisher E 在1894年提出“锁-钥匙模型学说”[11]，进而药物学家对其加以完善，认识到：药物分子发挥相应药效的前提是靶标与其相互契合，首先靶标受体与药物配体充分接近，调整到最佳的构象，使二者关键基团相互结合，诱导产生相互作用，进一步调整自身的取向，最终产生一个药物分子与靶点蛋白之间较为稳定的复合物空间构象。

反向分子对接方基于反向分子对接技术土贝母皂苷甲抗肿瘤机制研究史海龙，党琳，崔亚亚，王玉成，陈哲（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）摘 要：目的：确定土贝母皂苷甲抗肿瘤作用的靶标及其分子机制。

方法：采用Autodock Vina 软件，把土贝母皂苷甲与36个抗肿瘤的靶点进行反向分子对接，配体受体复合物三维结构和相互作用力图分别用Pymol-v0.99软件与MOE 2008软件演示。

结果：土贝母皂苷甲与多个抗肿瘤靶标具有较好的亲和性，其中与土贝母皂苷甲结合能在-8.5 kcal·mol -1以下的有6个。

结论：土贝母皂苷甲可以通过抑制酪蛋白激酶Ⅱ、金属基质蛋白酶-8、Src 激酶、胸苷酸合成酶、CDK2以及微管蛋白的活性，发挥抗肿瘤作用，为进一步研究土贝母皂苷甲用于临床抗肿瘤治疗提供一定的理论基础。

关键词：土贝母皂苷甲；抗肿瘤；反向分子对接中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 07- 0124- 06收稿日期：2015-12-10基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2013JK0779，2013JK0772）作者简介：史海龙（1981-），男，陕西西安人，讲师，博士研究生，研究方向：计算机辅助药物设计与生物大分子模拟。

Study on Antitumor Mechanism of Tubeimoside ⅠBased onMolecular Reverse Docking MethodSHI Hailong，DANG Lin，CUI Yaya，WANG Yucheng，CHEN Zhe（Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，Shaanxi，China）Abstract：Objective ：To investigate the target and molecular mechanism for the antitumor action of tubeimoside Ⅰ. Methods ：Using Autodock Vina software，reverse molecular dock quercetin with 36 antitumor targets；analyze the binding mode of tubeimoside Ⅰwith the targets. Results ：Tubeimoside Ⅰshows high affinity to many antitumor targets. There are 6 targets with binding free energy to quercetin lower than -8.5 kcal·mol -1. Conclusion ：Tubeimoside Ⅰexerts antitumor action by inhibiting the activity of casein kinase Ⅱ，human neutrophil collagense（MMP-8），Src kinase，thymidylate synthetase，CDK2，microtubulin as well as several protein kinase.Keywords：tubeimoside Ⅰ；antitumor；reverse molecular dockingDOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2016.07.03812518卷 辽宁中医药大学学报法对此理论进一步发扬光大，提出：以小分子配体化合物为配体探针，其来源可以是化学合成物、中草药天然产物，也可以是先导化合物等，将配体分子虚拟化地置于靶点受体活性位点的三维空间坐标中心区域，依据受体配体之间能量互补、几何互补以及化学环境互补的理论，在已知结构的靶点蛋白质数据库内搜寻与配体探针有较好亲和力的受体靶点蛋白质，以此预测药物潜在的作用靶点。

因此，反向分子对接方法的提出，为药物研发提供了一种新的思路，避免了后续生物学验证的盲目性，并且一定程度上较好地弥补实验能力的有限性。

此方法对于药物作用靶点预测、毒副作用预测、老药新用及新药研发提供了新的实验技术[12-14]。

基于以上思考，本文采用反向分子对接的技术，以土贝母皂苷甲为配体，以36个抗肿瘤靶点蛋白为受体，进行一对一分子对接计算，通过结合自由能分析，预测了土贝母皂苷甲的抗肿瘤潜在靶点及其分子机制，为土贝母皂苷甲单体成分作为抗肿瘤候选药物的进一步研发提供理论依据。

1 资料与计算方法1.1 准备初始结构采用ChemBioOffice2008软件中的ChemBioDraw 模块绘制出土贝母皂苷甲的二维结构，在利用ChemBio3D 模块将其转换为三维结构（pdb 格式文件），对土贝母皂苷甲的化合物3D 结构利用MM2力场优化（见图1）。

36个抗肿瘤药物的靶点蛋白的PDB 格式文件下载于靶标数据库（http：//www./pdtd/index.php）[15]。

药物潜在靶标数据库（Potential Drug Target Database，PDTD）是由中科院上海药物所蒋华良课题组与华东理工大学药学院李洪林课题组合作构建数据库，整合已知和潜在的7000多个重要药物靶点结构，涵盖349种生物功能和110种临床适应症。

PDTD 药物靶标数据库已得到国际公认权威杂志认可，其相关研究结果发表在2010年《Nucleic Acids Research》杂志上[16]。

36个抗肿瘤药物靶点及土贝母皂苷甲的结构需转换文件格式，利用Autodock Vina 软件的配套工具MGLTools 1.5.6[17]处理这些化合物，Gasteiger 电荷，合并非极性氢，由原先的pdb 文件格式转成Autodock Vina 程序可识别的pdbqt 文件格式，作为对接前的初始配体结构。

a.二维化学结构式b.能量优化后的空间结构图1 土贝母皂苷甲的结构1.2 分子对接的参数确定本研究采用的分子对接软件是AutoDock Vina，进行半柔性分子对接计算。

半柔性对接指只改变小分子配体的构象，而保持受体蛋白的刚性不变，先生成受体结合部位的格点盒子及其参数，接着根据拉马克遗传算法[18]，进行配体结构的进一步优化，然后发出配体与受体的对接计算指令，产生多个结合构象，从中寻找最佳的结合构象，最终依照半经验自由能函数作出对接结果评价。

因为AutoDock Vina 的优化算法较为复杂，所以其计算花费的时间相对于其他分子软件也较长，但精度更高。

利用AutoDock 进行反向分子对接之前，还需要设置合理的对接参数。

因此需要论证AutoDock Vina 分子对接软件中参数设置是否合理。

具体工作是：①依次从抗肿瘤靶点蛋白晶体复合物中将原配体分子提取出来；②运行AutoDock Vina，将每个靶点受体与原配体重新对接到设定的活性中心（原配体所在空腔）；③根据对接后的配体分子与原配体分子的均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）的大小判断对接参数设置的合理性。

参照文献，通常约定对接较好地重复出了配体受体原结合模式的条件是RMSD ≤0.2 nm [19]，同时可以认定其对接参数设置是合理的。

本研究进行30次靶点与原配体之间分子对接的计算，以RMSD ≤0.2 nm 为判断对接成功与否的阈值，统计成功对接出现的次数，分别确定了应用于36个不同抗肿瘤靶点的相应对接参数（见表1）。

并通过打分函数计算得到预测受体与原配体的理论结合能力均值，可作为反向对接36个抗肿瘤靶点筛选相关抑制剂时结合活性高低的参考。

1.3 分子对接方法富集因子的考察富集因子（Enrichment Factor，EF）计算，是一个考察分子对接程序适用性的重要工具[20]，主旨是从一个活性分子与诱饵分子的混合分子数据库中，检测分子对接程序能否有效地筛选出活性分子。

因此本研究也借助这一工具来检测AutoDock Vina 分子对接软件的筛选活性分子的能力。

活性分子与诱饵分子的结构文件下载于分子诱饵数据库辽宁中医药大学学报18卷DUD（http：///）。

分子诱饵数据库（A Directory of Useful Decoys，DUD）[20]是由美国加利福尼亚大学药物化学系Irwin及Shoichet课题组开发的验证型数据库，其目的是提供具有挑战性的诱饵以帮助测试对接算法的可靠性。