分子生物学第五章
合集下载
分子生物学 第五章 DNA的转座
转座作用
DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导 的遗传物质重排现象。
“转座”？
不十分准确，在转座过程中，可移位因子的一个 拷贝常常留在原来的位置上，在新位点出现的是 拷贝，因此，转座有别于同源重组，它依赖于 DNA的复制。 根据转座子复制与否，转座作用可分为:
单纯转移 复制转移
5.1转座子 转座子
5.4.3 TnA家族 家族
TnA家族都是比较大的转座子（-5kb以上）， 家族都是比较大的转座子（ 以上）， 家族都是比较大的转座子 以上 其特点是两端不含IS， 其特点是两端不含 ，但含有独立的转位酶基 因和抗药性基因。 因和抗药性基因。TnA家族包括许多类似的转 家族包括许多类似的转 位子。它们的一般结构均相类似， 位子。它们的一般结构均相类似，但有不同的 遗传标记(genetic markers)。 遗传标记 。
5.4.1 Tn10 许多转位子两端的IS具有完全相同的反向 许多转位子两端的 具有完全相同的反向 或同向）重复顺序。但亦有些Tn两端 两端IS不 （或同向）重复顺序。但亦有些 两端 不 完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 两端的IS（右侧IS10R，左侧为 两端的 （右侧 ，左侧为IS10L）即不 ） 完全相同。 完全相同。
IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R
IR IR
பைடு நூலகம்IR
IR IR
IR
两端的反向重复顺序长22bp。这 在IS10两端的反向重复顺序长 两端的反向重复顺序长 。 个22bp的反向重复即是转位酶所赖以识 的反向重复即是转位酶所赖以识 别的位点，因而为转位反应所必须。 别的位点，因而为转位反应所必须。由 的反向重复不完全相同， 于IS10R和IS10L的反向重复不完全相同， 和 的反向重复不完全相同 所以IS10R是Tn10转位所必须，而IS10L 转位所必须， 所以 是 转位所必须 的转位活性却仅为IS10R的1-10％（目前 ％（目前 的转位活性却仅为 的 ％（ 估计IS10R和IS10L之间约有 ％的差 之间约有2.5％ 估计 和 之间约有 异）。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
(推荐)分子生物学课件第五章
5.1 加帽 5.2 聚腺苷酸化 5.3 剪接 5.4 mRNA编辑 5.5 实验研究
2 / 48
5.1 Capping / 加帽
An mRNA that has been transcribed but is not yet ready for translation is called a pre-mRNA, or a primary transcript.
AAUAAA
GU
Polyadenylation
AAAAAAA - - - - - - AAAA
Poly(A) tail
16 / 48
The cleavage complex / 切割复合体
Cleavage complex
CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) CstF (cleavage stimulation factor)
10 / 48
2. Helps transport into cytoplasm 帮助转运到细胞质中
Discussed in Chapter 7
11 / 48
3. Enhances translation / 增强转译
Cap-binding protein
No translation occurs.
the DNA, and the transcript 这一转录产物会立即被
is immediately translated 转译成蛋白质。在真核
into protein. In eukaryotes, a series of modifications
生物中，转录时以及转
occur to mRNA during and 录后会对mRNA进行一
分子生物学 第五章 分子生物学
（五）转录过程
（a－2）添加TFIIH, TFIIE和ATP使得DNA在 起始区解链，RNA聚合酶的最大亚基的CTD 部分磷酸化。
（五）转录过程
(b) ATP供能下, TFIIH的解旋酶活 性 引起DNA进一 步解旋，转录泡 增大。RNA聚合 酶II离开启动子。
（五）转录过程
(c) TEFb对CTD
6. RNA编辑
• RNA编辑是指原始转录 产物的序列发生变化， 从而导致编码的蛋白与 基因组编码的不同。
第四节 反转录
一、概念
反转录：以RNA为模板合 成DNA的过程称为反转录。 反转录过程由反转录酶催 化，合成的DNA链称为 cDNA。
二、反转录酶
• 反转录过程由反转录酶催化，合成的DNA链 称为cDNA。 具有以下活性： DNA聚合酶活性（需要RNA为引物、没有校 正功能）； RNase H活性：切除杂合分子中的RNA； DNA指导的DNA聚合酶活性：合成第二条 DNA分子。
分子生物学 第五章 分子生物学
本章重点
1.RNA聚合酶的结构及功能。 2.原核生物启动子、终止子的结构及功能。 3.增强子、沉默子和绝缘子的概念。 4.RNA的加工 5.核酶的概念。 6.反转录的概念。
本章内容
第一节 原核生物的转录 第二节 真核生物的转录 第三节 RNA的加工 第四节 反转录
第一节 原核生物的转录 一、基本概念
增强子和启动子的差异
2.沉默子
• 沉默子是能够抑制附近基因表达的DNA序列。 沉默子对基因转录调控的作用特点与增强子 类似，距离和方向都无关紧要，因此也称为 负增强子。
3.绝缘子
• 绝缘子是一段能阻断增 强子使转录失活或防止沉 默子使异染色质延伸保护 转录进行的DNA元件。
分子生物学-第五章--蛋白质的生物合成可编辑全文
遗传密码的连续性
遗传密码的摆动配对
密码的简并性具有的生物学意义
它允许生物体的DNA碱基有较大变异 的余地，使基因突变可能造成的为害降至 最低程度，而不影响物种形状的表达，对 环境的适应和物种遗传的稳定。
例如细菌DNA中G+C含量变动很大， 但不同G+C含量的细菌却可以编码出相同 的多肽链。
这归因于同义密码子的分布规则。
摇摆假说
由于同义密码子的第1、2个碱基是保守的，第3个碱 基是可变的，因此解读同义密码子的tRNA的反密码子的 第1个碱基必定具有最小的专一性，也就是说它与密码子 第3个碱基之间的配对原则具有一定范围的灵活性。
由于反密码子位于tRNA的突环上，因此反密码子三 联体的排列就会呈弯曲弧线，不能与密码子保持完全的平 行，加上反密码子的第1个核苷酸位于非双链结构的松弛 环内，摇摆的自由度较大，从而导致密码子的第3个核苷 酸和反密码子的第1个核苷酸之间可能形成非标准的碱基 配对，反密码子的这一位点也被称为摇摆位点（一般为第 34位碱基）。
在原核生物和真核生物中，均存在另一种 携带蛋氨酸的tRNA，识别非起始部位的蛋氨 酸密码，AUG。
tRNA在将密码的信息及排列转换为多肽链中 的氨基酸序列的过程中起着中心及桥梁的作用。
最简单的tRNA只有74个核苷酸，而最大的也 很少超过94个核苷酸。这个特点使得tRNA成为最 先被定序的核酸。
序列测定的结果揭示tRNA是同源性相对较高 的RNA分子，tRNA分子含有大量修饰核苷酸和可 能存在各种碱基配对的二级结构。
能 够 识 别 mRNA 中 5′ 端 起 始 密 码 AUG 的 tRNA是一种特殊的tRNA，称为起始tRNA。
在 原 核 生 物 中 ， 起 始 tRNA 是 一 种 携 带 甲 酰蛋氨酸的tRNA，即tRNAifmet；
分子生物学第5章、第6章
•DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为 遗传重组，或基因重排。→ 重组DNA •真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染 色体之间的交换；细菌及噬菌体的基因组为单倍体， 来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传 重组。 •DNA重组对生物进化起着关键的作用。 •重组分类：同源重组(homologous recombination) 、 位点特异性重组(site-specific recombination)、 转座重组(transposition recombination)和 异常重组(illegitimate recombination)。
1. 互变异构体：碱基发生烯醇式-酮式互变异构或者氨 基-亚氨基互变异构时，使碱基错配。 2. 脱氨基作用：碱基上氨基自发脱落，或在诱变剂的 作用下脱去氨基，则C→U、A →I、G →X，引起子 链错误。 3. DNA聚合酶“打滑”：DNA复制时发生碱基的环出现 象，引起一个或数个碱基的插入或缺失，易发生于 几个相同碱基串联的部位。 4. 活性氧（O3）引起的诱变：①氧化碱基与C、A配对， 造成GC → TA颠换，这种损伤可以积累；②H2O2造成 的DNA氧化损伤，此类损伤一般能被修复。
核苷酸切除修复
错配修复
错配修复对 DNA复制忠实 性的贡献力达 102-103，DNA 子链中的错配 几乎完全都被 修正，充分反 映了母链的重 要性。
大肠杆菌甲基化引 导的错配修复
重组修复
易错修复和SOS反应
•SOS反应：当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而
诱发出一系列复杂的反应。
•这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。
5.3.4 基因突变的后果
基因突变的后果主要是生物功能的丧失。 某一基因突变后使其所表达的蛋白质或酶失活， 有时还会引起多种酶的缺乏。 有些突变可产生功能获得性显性表现型。 典型的人体细胞突变每个基因每代发生率为107～10-5，但并非所有的突变都会导致疾病。
分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
分子生物学第5章
序列3、4不能形成衰减子结构，下游的结构基因可以被有效转 录
(2)当色氨酸充足时，色氨酰tRNA供给充足，核糖体迅速翻译序列1
合成前导肽，并对序列2形成约束，使序列2、3不能形成茎环结 构，转而序列3、4形成转录终止子结构衰减子，使下游正在转 录结构基因的RNA聚合酶脱落，终止转录
转录衰减机制:
新生肽链 核糖体
5’ 1 2
衰减子结构 (attenuator)
3
4
mRNA
UUUU 3’
DNA
trp 密码子当色氨酸来自度高时核糖体5’
1
2
3 4
当色氨酸浓度低时
高Trp时： Trp-tRNATrp 存在
核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2
片段3，4形成发夹结构 类似于不依赖ρ因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物 转录、翻译偶联,产生前导肽
前导序列：在trp mRNA5'端trpE基因的起始密码前一 个长162nt的mRNA片段。
第10和第11位上有相 邻的两个色氨酸密码子
转录与翻译的偶联是衰减调控的基础 色氨酰tRNA浓度的变化是衰减调控的信号
(1)当色氨酸缺乏时，色氨酰tRNA供给不足，合成前导肽的核糖体
停滞于序列1的色氨酸密码子位点，序列2、3形成茎环结构，使
结合乳糖、G存在与否及与操纵子正、负控因素、 基因开放与关闭情况如下：
葡萄糖（G） 乳糖 基因开放 基因关闭 机理简述（学生填充）
①
×
× √ √
√
× × √
√
√ √ √
CAP正控、乳糖去阻遏、基因开放、转录进行 不能诱导去阻遏，CAP即使结合，基因未开放 细菌优先用G，无CAP结合，无诱导去阻遏 CAMP-CAP复合物无，CAP位点空，去阻遏 也无RNA pol结合
(2)当色氨酸充足时，色氨酰tRNA供给充足，核糖体迅速翻译序列1
合成前导肽，并对序列2形成约束，使序列2、3不能形成茎环结 构，转而序列3、4形成转录终止子结构衰减子，使下游正在转 录结构基因的RNA聚合酶脱落，终止转录
转录衰减机制:
新生肽链 核糖体
5’ 1 2
衰减子结构 (attenuator)
3
4
mRNA
UUUU 3’
DNA
trp 密码子当色氨酸来自度高时核糖体5’
1
2
3 4
当色氨酸浓度低时
高Trp时： Trp-tRNATrp 存在
核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2
片段3，4形成发夹结构 类似于不依赖ρ因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物 转录、翻译偶联,产生前导肽
前导序列：在trp mRNA5'端trpE基因的起始密码前一 个长162nt的mRNA片段。
第10和第11位上有相 邻的两个色氨酸密码子
转录与翻译的偶联是衰减调控的基础 色氨酰tRNA浓度的变化是衰减调控的信号
(1)当色氨酸缺乏时，色氨酰tRNA供给不足，合成前导肽的核糖体
停滞于序列1的色氨酸密码子位点，序列2、3形成茎环结构，使
结合乳糖、G存在与否及与操纵子正、负控因素、 基因开放与关闭情况如下：
葡萄糖（G） 乳糖 基因开放 基因关闭 机理简述（学生填充）
①
×
× √ √
√
× × √
√
√ √ √
CAP正控、乳糖去阻遏、基因开放、转录进行 不能诱导去阻遏，CAP即使结合，基因未开放 细菌优先用G，无CAP结合，无诱导去阻遏 CAMP-CAP复合物无，CAP位点空，去阻遏 也无RNA pol结合
分子生物学课件第五章 同源重组、位点特异性重组
The Holliday Model
* This model of recombination was first proposed by Robin Holliday in 1964 and re-established by David Dressler and Huntington Potter in 1976 who demonstrated that the proposed
Fig. 22.5 f-h
8. The nicks are sealed by DNA ligase, yielding a Holliday junction.
9. Branch migration occours, sponsored by RuvA and RuvB.
10. RuvC resolves the structure.
6. The invading strand basepaired with a homologous region, releasing SSB and RecA.
7. RecBCD nicks the loopingout strand. RecA and SSB helps strand exchange.
Roles
Generating new gene/allele combinations (crossing over during meiosis)
Generating new genes (e.g., IgG rearrangement)
Integration of a specific DNA element DNA repair
* The two molecules must share a region of homologous (i.e. nearly identical) DNA sequence - a minimum of 30-151 bp is required.
《分子生物学》第五章期末习题
《分子生物学》第五章期末习题第5章原核生物基因表达调控-习题答案一、名词解释基因表达调控：所有生物的信息，都是以基因的形式储存在细胞内的DNA（或RNA）分子中，随着个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统，转变成蛋白质或功能RNA分子，执行各种生理生物化学功能。
这个从DNA到蛋白质或功能RNA的过程被称之为基因表达，对这个过程的调节称之为基因表达调控。
组成性基因表达：是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。
其基因表达产物通常是对生命过程必须的或必不可少的，一般只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，且较少受环境因素的影响及其他机制调节，也称为基本的基因表达。
管家基因：某些基因产物对生命全过程都是必须的获必不可少的。
这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中均表达，被称为管家基因。
诱导表达：是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。
阻遏表达：是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。
反式作用因子：又称为分子间作用因子，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。
它们由某一基因表达后通过与特异的顺式作用元件相互作用，反式激活另一基因的转录。
操纵子：是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。
SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处的一种4~7个核苷酸的保守片段，它与16S rRNA 3’端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
根据首次识别其功能意义的科学家命名。
阻遏蛋白：是一类在转录水平对基因表达产生负控作用的蛋白质，在一定条件下与DNA结合，一般具有诱导和阻遏两种类型。
在诱导类型中，信号分子（诱导物）使阻遏蛋白从DNA释放下来；在阻遏类型中，信号分子使阻遏蛋白结合DNA，不管是哪一种情况，只要阻遏蛋白与DNA结合，基因的转录均将被抑制。
分子生物学 第五章
体外翻译系统中加入同位素标记的氨基酸，然后分析所合
成多肽的氨基酸顺序，再进行比较分析来推测各氨基酸的
密码子。
三、Khorana的实验
Khorana就是用这种方法将所有的遗传密码都破译了。 这项实验还同时证实了三联密码子的准确性以及简并性的存在。
Robter Holley发现并得到了 tRNA的精确结构，应用上述各种方 法仅用了4年时间，于1965年完全查清了20种基本氨基酸所对应 的全部61个密码子，编出了遗传密码字典（教材表 5-4）。AUG 为起始密码子（initiation codon），其余61个密码子对应20种氨 基酸。另外的3个密码子（UAA、UAG和UGA）是终止密码子 （termination codons or stop codons），它们不编码任何氨基酸， 只结束蛋白质的合成。
除了色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其它氨基酸 都有一个以上的密码子，如：亮氨酸、精氨酸、丝氨酸 都有6个密码子，大多数氨基酸有2个、3个或4个密码子 （教材表5-5）。
二、密码的简并性(degeneracy) 密码子的简并性可以减少有害的突变，具有非常 重要的生物学意义。
三、密码的摆动性
密码的简并性往往表现在密码子的第三位碱基上，如甘 氨酸的密码子是GGU、GGC、GGA、GGG，丙氨酸的 密码子是GCU、GCC、GCA、GCG，它们的前两位碱基 是相同的，只是第三位碱基不同。有些氨基酸只有两个密 码子，通常第三位碱基或者都是嘌呤，或者都是嘧啶。 显然，密码子的专一性基本上取决于前两位碱基，第三位 碱基起的作用有限。即第三位碱基有较大的灵活性。
蛋白质分子的20种氨基酸编码，不可能是一对一的关系，两个碱基 决定一个氨基酸也只能编码16种氨基酸，如果用三个碱基决定一个 氨基酸，43=64，就足以编码20种氨基酸。这是编码氨基酸所需碱 基的最低数目，故密码子应是三联体（triplet）。
成多肽的氨基酸顺序，再进行比较分析来推测各氨基酸的
密码子。
三、Khorana的实验
Khorana就是用这种方法将所有的遗传密码都破译了。 这项实验还同时证实了三联密码子的准确性以及简并性的存在。
Robter Holley发现并得到了 tRNA的精确结构，应用上述各种方 法仅用了4年时间，于1965年完全查清了20种基本氨基酸所对应 的全部61个密码子，编出了遗传密码字典（教材表 5-4）。AUG 为起始密码子（initiation codon），其余61个密码子对应20种氨 基酸。另外的3个密码子（UAA、UAG和UGA）是终止密码子 （termination codons or stop codons），它们不编码任何氨基酸， 只结束蛋白质的合成。
除了色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其它氨基酸 都有一个以上的密码子，如：亮氨酸、精氨酸、丝氨酸 都有6个密码子，大多数氨基酸有2个、3个或4个密码子 （教材表5-5）。
二、密码的简并性(degeneracy) 密码子的简并性可以减少有害的突变，具有非常 重要的生物学意义。
三、密码的摆动性
密码的简并性往往表现在密码子的第三位碱基上，如甘 氨酸的密码子是GGU、GGC、GGA、GGG，丙氨酸的 密码子是GCU、GCC、GCA、GCG，它们的前两位碱基 是相同的，只是第三位碱基不同。有些氨基酸只有两个密 码子，通常第三位碱基或者都是嘌呤，或者都是嘧啶。 显然，密码子的专一性基本上取决于前两位碱基，第三位 碱基起的作用有限。即第三位碱基有较大的灵活性。
蛋白质分子的20种氨基酸编码，不可能是一对一的关系，两个碱基 决定一个氨基酸也只能编码16种氨基酸，如果用三个碱基决定一个 氨基酸，43=64，就足以编码20种氨基酸。这是编码氨基酸所需碱 基的最低数目，故密码子应是三联体（triplet）。