宏基因组技术在微生物中的应用

宏基因组文库既包括了可培养的,又包括了未培养的 微生物遗传信息,因此增加了获得新生物活性物质的 机会。 采用构建宏基因组文库的策略筛选新的基因资源及 其表达活性产物的一般流程可以归纳为:样品和基因 (组)的富集;提取特定环境中的基因组DNA或mRNA; 构建宏基因组DNA或cDNA文库;筛选目的基因;目的 基因活性产物表达。
2.4宏基因组文库的构建 载体的选择

载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的 地位。载体系统的选择主要依赖于DNA提取 质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛 选方法。根据克隆载体的不同宏基因组文库 可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、 噬菌体类载体文库。

早期宏基因组文库主要以质粒载体和大肠杆菌宿主 细胞构建而成的小片段(<15kb)文库。该文库操作简 便、拷贝数高、对DNA质量要求不高,适合纯度低或 剪切较严重的DNA模版。但插入片段小,筛选量大, 活性比率低,对大基因簇无能为力,主要适用于分析 新的基因序列信息及筛选编码代谢相关的单一基因 或小操纵子。然而,很多微生物活性物质是其次生代 谢产物,代谢途径由多基因簇调控,因此尽量插入大 片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必 要的。
2.3宏基因组DNA的提取

获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总 DNA是宏基因组文库构建的难点之一。


近年已有多种宏基因组DNA的提取纯化方法陆续建立起来, 大体可分为两类:一类是直接提取法,又称原位提取法。这类 方法不经过样品中微生物的培养和分离,通过化学法、酶解法 或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放, 并对DNA进行纯化。 该法操作简便、省时、成本低,所获得DNA具有较好的完整 性,并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但常会出现细 胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效 地去除等问题,所以一般需要进一步的DNA纯化处理,同时所 提取获得的DNA片段较小(1kb~50kb),主要适用于小片段文 库的构建。
宏基因组技术在 微生物中的应用
1.宏基因组概述 2.环境宏基因组学基本技术 3.环境宏基因组学技术的主要瓶颈

1.宏基因组概述 1.1.微生物资源开发应用的新途径

据估计每克土壤样品中可含有高达4,000种的不同微生物， 1g土壤就包含6. 1×107个基因。 传统途径—培养途径 开发环境微生物基因资源较为传统的研究途径是:分离微生物, 获得纯培养,基因表达产物活性检测、活性物质的分离纯化直 至开发利用。这一途径被证明是十分有效的,也获得了诸多有 应用价值的活性物质。但是,环境中仅有0. 1% ~1%的微生物 能够采用现有培养技术进行分离培养,在今天采用传统培养方 法已很难发现新的活性物质,极大地限制了未培养微生物基因 资源的开发利用。

新途径—宏基因组途径 近年来发展起来的宏基因组克隆技术,直接提 取环境样品核酸进行遗传操作,避开了微生物 分离培养问题,极大地扩展了微生物资源的利 用空间。已在土壤生态环境、海洋生态环境 和各种极端环境中开展应用。
1.2.宏基因组定义

“1998年Handelsman等首次提出宏基因组的 概念。一种以环境样品中的微生物群体基因 组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为 研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化 关系、功能活性、相互协作关系、及与环境 之间的关系为研究目的的新的微生物研究方 法。

基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术 (SIP),原理是采用稳定同位素标记底物,其中的“重” 原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中,采用密度 梯度离心的方法将“重”的DNA与“轻”组分分离, 被标记的“重”核酸可以作为PCR的模板,用来构建 宏基因组文库。此外,还有报道利用抑制性消减杂交 技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获 技术及DNA微阵技术等技术来富集目的基因。


另一类是间接提取法,即异位提取法,是利用离心介 质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分 离出来,再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞 提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较 少,纯度较高、DNA完整性好(20kb~500kb),适合构 建大片段的宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费 时、成本高、偏差大、DNA得率较低,其产率只是直 接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往往不能完全代 表样品所在生境的生态学多样性。
图2
2.环境宏基因组学基本技术


环境宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中 所有微生物的基因组DNA,克隆到合适的载体,通过 构建宏基因组文库,将环境中全部微生物的核酸信息 收集在一起,运用序列筛选或功能筛选方式从文库中 获得有用的酶、抗生素等生物活性物质及相关基因。 其前端关键性技术是环境DNA(environmental DNA,eDNA)的提取,eDNA提取方法的精确程度将直 接决定文库中微生物信息的精确度;下游关键性技术 是文库的分析与筛选技术。
2.2.环境宏基因组文库筛选技术

环境宏基因组文库的筛选策略主要分为序列 筛选和功能筛选2种。序列筛选策略是先从文 库中获得目的基因,继而对之异源表达,得到具 有生物活性的产物;功能筛选策略则是先获得 具有生物活性的阳性克隆子,再通过插入片段 测序,得到相应的基因结构。2种分析策略对 于充分利用宏基因文库资源都是必要的。
Hale Waihona Puke Baidu 2.1环境样品及目的基因组富集

在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总 DNA的一小部分,对环境样品的预富集可以大 大提高目的基因的检出几率。目前预富集技 术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。

细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对 目的微生物进行富集培养,最常用的方法是底 物选择,此外还包括营养选择及物理化学指标 选择。但是由于富集培养选择性地富集了具 有快速生长特性的菌群,因此导致大部分物种 多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁 迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条 件,可以从一定程度上克服这种方法的局限性。