组织工程学-第十章
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Soo-Hong Lee, et al, J Biomed Mater Res 66A: 29–37, 2003
PLGA
支架结构会影响细胞的黏附、铺展和增殖
支架的消毒灭菌技术
几种标准灭菌方法对脂肪族聚酯材料灭菌处理的比较
灭菌方法
优点
缺点
蒸汽法 无毒性物质残留
（高压，120-135℃）
由于高压水蒸汽引起聚酯水 解，导致材料降解、制品变形
阳离子脂质体-磁性纳米四氧化三铁（MCL）的细胞毒性
【结果】 在本文试验条件下，未发现MCL对成纤维细胞的毒性。（MCL对成
纤维细胞增殖的毒性计量为100pg/cell）
灌注法 玻璃管
【特点】 有利于细胞进入支架内部；细胞接种均匀；细胞接
种数量多；细胞接种率高。
高度感应器
灌 注
法
支架
静
态
U型管
法
样品室
负压接种法均匀性和重复 性的定量分析
（肌肉干细胞接种在热致 相分离法制备的聚氨酯多 孔管状支架上）
水凝胶法
【方法】 将高密度细胞悬液分散在可形成凝胶的水溶液中，
通过接种法、或负压吸入法，使其进入支架内部，然
后使其凝胶。 【特点】 细胞分布均匀，可防止细胞漏出，接种细胞数量多，接种率 高；同时对支架有一定的增强作用。可方便引入生长因子。
成、孔隙率、孔径、孔间交通情况、表面形貌特征等； 6）在上述问题基本阐明后，进行体内/外组织构建，形成工程化组
织。
10.1 种子细胞与支架材料的接种
10.1.1 细胞接种前的准备
1. 适当的细胞密度 2. 良好的种子细胞分化程度
¾ 细胞悬液的制备
3. 控制种子细胞扩增培养条件
¾ 支架的准备 ¾ 细胞与支架的接种技术
1. 根据不同组织，选择不同材料； 2. 根据要修复的组织部位，选择具有
合适宏观和微观结构的支架； 3. 对支架进行严格消毒灭菌 4. 如果必要，对支架进行预湿处理
1. 浸渍法 2. 接种法（沉淀法） 3. 动态接种法
4. 灌注法 5. 负压吸附法 6. 水凝胶法
PGCL
PLGA：聚（乳酸－羟基乙酸）共聚物 PGCL：聚（羟基乙酸－己内酯－乳酸）共聚物
软骨细胞接种在PGA纤维支架上的结果 （细胞悬液初始密度对接种效率的影响）
【磁场辅助接种】 先将阳离子脂质体吸附在磁性纳米四氧化
三铁（MCL）上，然后通过阳离子的作用吸 附在细胞上，然后在磁场作用下接种细胞，
成纤维细胞对MCL的捕获
MCL对成纤维细胞的毒性 无MCL
有MCL
胶原支架的接种结果 Kazunori Shimizu, et al., J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 77B: 265–272, 2006
干热法 （160-190℃）
无毒性物质残留
PLA、PLGA等在此消毒条件 下，会发生熔融或软化
射线
高穿透性，化学反 射线的不稳定性和破坏性，会
（离子或γ-射线） 应性低，作用快 使材料发生交联或断裂反应
气体法 （环氧乙烷）
在较低温度进行
灭菌完成后，需较长时间除去 残留环氧乙烷气体，环氧乙烷 具有生理毒性
剧烈扰动接种 剧烈扰动接种
搅拌接种
静态接种
100 rpm
300 rpm 不同转速下，人成骨细胞在支架内部的分布
Gordana Vunjak-Novakovic, et al., Dynamic Cell Seeding of Polymer Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering, Biotechnol. Prog. 1998, 14, 193-202
原始
环氧乙烷
电子束
γ 60Co
消毒方法对胶原纤维形貌的影响（AFM）
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 63 (2006) 176–187
等离子体灭菌处理对PLGA75/25多孔支架的体积和灭菌效率的影响
等离子体处理 功率（W） 时间（min）
Intrusion volume (ml/g)
4
3
2
1
0
0
0.5 1 2 4 24 48
Time (h)
Anthonios G Mikos, et al., Biomaterials, 1994, 55-58
10.1.2 细胞与支架的接种技术
【优点】
浸渍法
Biblioteka Baidu
操作简单，不易导致污染，对设备、仪器的要求不高。 【缺点】
【结果】接种培养20h，用扫描电镜观察三种接种方法对接种率的影响 Byung-Soo Kim,et al., Biotechnol Bioeng, 57: 46–54, 1998
【例】在摇床上，不同转速下，对PET纤维支架的接种
接种效率
人成骨细胞
接种效率
软骨细胞
100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
硬段比例较大
软段比例较大
20 s UV-臭氧消毒
环氧乙烷消毒
不同消毒方法对聚氨酯电纺纳米无纺毡形貌的影响
支架的预湿处理
聚合物 PLLA
孔隙率 0.88 6
5
孔体积 （ml/g）
5.82
浸入液体体积（ml/g）
乙醇（1h） 水（48h，乙醇预湿1h）
4.06
4.60
prewetted with ethanol dry
山羊骨髓间质细胞在磷酸钙支架上的培养结果（亚甲基蓝染色，19d） 左：静态接种；右：灌注法接种
Frank W. Janssen, et al., Biomaterials 27 (2006) 315–323
静态 负压
Lorenzo Soletti, et al., A seeding device for tissue engineered tubular structures, Biomaterials 27 (2006) 4863–4870
Athanasiou KA, et al., Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of PLGA. Biomaterials, 1996, 17: 93~102
【消毒方法】 (Ernst Magnus Noaha, et al., Biomaterials 23 (2002) 2855–2861) 材料 —— 胶原支架，固液相分离法制备，孔径20um 环氧乙烷法（EO）—— 100％EO蒸汽、70％湿度、55oC、7h； 40oC空气流中120h 60Co γ射线 —— 25 kGy（2.5Mrad）
2500rpm
细胞活力（总量）
单个细胞的活力
W.T. Godbey, et al., A novel use of centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds, Biomaterials 25 (2004) 2799–2805
10.2 影响细胞与支架复合的因素 10.2.1 支架材料的影响
不同方法所引起的PLGA75/25多孔支架体积和分子量的比较
方法 环氧乙烷
分子量变化 （%）
－12
体积变化 （%）
－50
灭菌效率（%） (n=10)
100
γ-射线
氩等离子体 （100W，4min）
70%乙醇水溶液
－54 ＋36
0
0
100
0
100
0
不定，一般 >70
消毒：disinfection；灭菌：sterilization
组织工程学
蔡晴
10
材料科学与工程学院
第 10 章 细胞与支架的联合培养技术
概述 —— 联合培养的用途和意义
1）评价支架材料对细胞的毒副作用； 2）考察细胞对支架材料的选择性； 3）研究细胞与支架材料的相互作用关系及其机制； 4）研究细胞接种在支架材料上的方法、数量、密度； 5）研究适合细胞生长，进行新陈代谢最佳材料结构，包括材料的组
【例】 将细胞分散在阳离
子胶原溶液中，用此溶 液充满支架孔隙，然后 在支架表面覆盖上阴离 子型的聚合物（如
PolyHEMA-MMAMAA）使之凝聚。
离心法
【方法】 将细胞悬液和支架装在试管中，放入离心机在设定
的转速下离心。
归一化的支架上的蛋白质含量
Yi-Chin Toh, et al., Application of a polyelectrolyte complex coacervation method to improve seeding ef.ciency of bone marrow stromal cells in a 3D culture system, Biomaterials 26 (2005) 4149–4160
D. Wendt, et al., Biotech. Bioeng., 84(2), 2003, 205-214
接种效率
接种细胞分布均匀性
软骨细胞在聚对苯二甲酸乙二醇酯支架上的接种比较
负压吸附法
【优点】 有利于细胞进入支架内部；细胞接种均匀；细胞接
种数量多；细胞接种率高。 【缺点】 负压吸引的压力不易掌握；容易污染。
样品发生体积 变化率（%）
灭菌效率（%） (n=10)
2
0
60
4
0
60
33
5
0
60
10
20a
70
2
0
60
3
0
80
100
4
0
100
5
20b
100
10
100c
100
注：a、10个样品中有2个体积收缩～48%；b、10个样品中有2个体积收缩～30%； c、所有的样品体积均收缩～50%。
Holy CE, Cheng C, Davies JE, et al. Biomaterials, 2001, 22: 25-31
¾ 细胞密度的影响
研究表明：低密度细胞不能形成关节软骨。
¾ 细胞代数的影响
组织工程化组织的构建以原代细胞为最好。
接种细胞的数量有限，接种率低，很多细胞被浪费。
接种法
【优点】 操作简便，可通过多次沉淀方法提高细胞的接种数量。
【缺点】 接种的细胞不均匀；易从筛网状支架的网孔中漏出，影
响细胞接种数量。
动态培养
【特点】 将支架浸没在高密度细胞悬液中，采用搅拌、震荡或旋
转培养系统，可使细胞更均匀、更多地附着在支架上。
【支架】用聚乳酸溶液将聚羟基乙酸纤维（直径12µm）排成的2mm厚无纺 支架粘连成型，孔隙率97％，支架密度50mg/cm3。
【种子细胞】平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs） 细胞悬液密度0.1～2×107 cells/ml
【接种方法】 静态接种——将50ml 细胞悬液（5 × 106 cells/ml）注射入PGA支架 搅拌接种——将PGA支架浸入40ml 细胞悬液（2 × 106 cells/ml）以 50rpm搅拌速度，于37oC下搅拌20h（在100ml烧瓶中进行） 剧烈扰动接种——将0.3ml 细胞悬液（2 × 107 cells/ml）注射入PGA 支架，装入试管，然后在100rpm水平摇床上晃动20h
单个细胞荧光强度
0rpm 100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
单个细胞荧光强度
100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
0rpm 100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
J Biomed Mater Res 66A: 425–431, 2003
搅拌下接种
静态接种 搅拌接种
EO灭菌
射线灭菌
接种细胞后，支架的表面积随时间变化
MTT法细胞增殖活力
【结论】
γ射线消毒会引起胶原的断链，并引起支架的显著收缩，不利于后续的 细胞的培养。EO法对胶原支架的影响较小，但要注意的是：在支架消毒后 要在40oC的空气流中脱气至少5天后，才能使支架中的残留EO降到无毒水平 （7.69mg/g）。
¾ 支架的含水量
支架材料亲疏水性的影响 支架的预湿处理
¾ 支架的结构
孔的贯穿程度和孔径大小直接决定细胞能否进入支架内部。
¾ 支架材料的表面性质
材料的表面电荷、亲疏水性、化学组成、基团特性和表面几何 形状等都会对细胞的黏附和生长有重要影响。
10.2.2 细胞的影响
¾ 细胞对材料存在一定的选择性
研究发现：成纤维细胞和肌腱细胞在甲壳素材料上不能生长。
分子量 支架体积
重量
不同消毒方法对PLGA支架后续降解的影响 (■) 乙醇; (▲) 等离子体; (●) γ-射线；(*) 环氧乙烷
原始电纺无纺毡
Effects of sterilisation method on surface topography and in-vitro cell behaviour of electrostatically spun scaffolds，Biomaterials 28 (2007) 1014–1026
PLGA
支架结构会影响细胞的黏附、铺展和增殖
支架的消毒灭菌技术
几种标准灭菌方法对脂肪族聚酯材料灭菌处理的比较
灭菌方法
优点
缺点
蒸汽法 无毒性物质残留
（高压，120-135℃）
由于高压水蒸汽引起聚酯水 解，导致材料降解、制品变形
阳离子脂质体-磁性纳米四氧化三铁（MCL）的细胞毒性
【结果】 在本文试验条件下，未发现MCL对成纤维细胞的毒性。（MCL对成
纤维细胞增殖的毒性计量为100pg/cell）
灌注法 玻璃管
【特点】 有利于细胞进入支架内部；细胞接种均匀；细胞接
种数量多；细胞接种率高。
高度感应器
灌 注
法
支架
静
态
U型管
法
样品室
负压接种法均匀性和重复 性的定量分析
（肌肉干细胞接种在热致 相分离法制备的聚氨酯多 孔管状支架上）
水凝胶法
【方法】 将高密度细胞悬液分散在可形成凝胶的水溶液中，
通过接种法、或负压吸入法，使其进入支架内部，然
后使其凝胶。 【特点】 细胞分布均匀，可防止细胞漏出，接种细胞数量多，接种率 高；同时对支架有一定的增强作用。可方便引入生长因子。
成、孔隙率、孔径、孔间交通情况、表面形貌特征等； 6）在上述问题基本阐明后，进行体内/外组织构建，形成工程化组
织。
10.1 种子细胞与支架材料的接种
10.1.1 细胞接种前的准备
1. 适当的细胞密度 2. 良好的种子细胞分化程度
¾ 细胞悬液的制备
3. 控制种子细胞扩增培养条件
¾ 支架的准备 ¾ 细胞与支架的接种技术
1. 根据不同组织，选择不同材料； 2. 根据要修复的组织部位，选择具有
合适宏观和微观结构的支架； 3. 对支架进行严格消毒灭菌 4. 如果必要，对支架进行预湿处理
1. 浸渍法 2. 接种法（沉淀法） 3. 动态接种法
4. 灌注法 5. 负压吸附法 6. 水凝胶法
PGCL
PLGA：聚（乳酸－羟基乙酸）共聚物 PGCL：聚（羟基乙酸－己内酯－乳酸）共聚物
软骨细胞接种在PGA纤维支架上的结果 （细胞悬液初始密度对接种效率的影响）
【磁场辅助接种】 先将阳离子脂质体吸附在磁性纳米四氧化
三铁（MCL）上，然后通过阳离子的作用吸 附在细胞上，然后在磁场作用下接种细胞，
成纤维细胞对MCL的捕获
MCL对成纤维细胞的毒性 无MCL
有MCL
胶原支架的接种结果 Kazunori Shimizu, et al., J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 77B: 265–272, 2006
干热法 （160-190℃）
无毒性物质残留
PLA、PLGA等在此消毒条件 下，会发生熔融或软化
射线
高穿透性，化学反 射线的不稳定性和破坏性，会
（离子或γ-射线） 应性低，作用快 使材料发生交联或断裂反应
气体法 （环氧乙烷）
在较低温度进行
灭菌完成后，需较长时间除去 残留环氧乙烷气体，环氧乙烷 具有生理毒性
剧烈扰动接种 剧烈扰动接种
搅拌接种
静态接种
100 rpm
300 rpm 不同转速下，人成骨细胞在支架内部的分布
Gordana Vunjak-Novakovic, et al., Dynamic Cell Seeding of Polymer Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering, Biotechnol. Prog. 1998, 14, 193-202
原始
环氧乙烷
电子束
γ 60Co
消毒方法对胶原纤维形貌的影响（AFM）
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 63 (2006) 176–187
等离子体灭菌处理对PLGA75/25多孔支架的体积和灭菌效率的影响
等离子体处理 功率（W） 时间（min）
Intrusion volume (ml/g)
4
3
2
1
0
0
0.5 1 2 4 24 48
Time (h)
Anthonios G Mikos, et al., Biomaterials, 1994, 55-58
10.1.2 细胞与支架的接种技术
【优点】
浸渍法
Biblioteka Baidu
操作简单，不易导致污染，对设备、仪器的要求不高。 【缺点】
【结果】接种培养20h，用扫描电镜观察三种接种方法对接种率的影响 Byung-Soo Kim,et al., Biotechnol Bioeng, 57: 46–54, 1998
【例】在摇床上，不同转速下，对PET纤维支架的接种
接种效率
人成骨细胞
接种效率
软骨细胞
100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
硬段比例较大
软段比例较大
20 s UV-臭氧消毒
环氧乙烷消毒
不同消毒方法对聚氨酯电纺纳米无纺毡形貌的影响
支架的预湿处理
聚合物 PLLA
孔隙率 0.88 6
5
孔体积 （ml/g）
5.82
浸入液体体积（ml/g）
乙醇（1h） 水（48h，乙醇预湿1h）
4.06
4.60
prewetted with ethanol dry
山羊骨髓间质细胞在磷酸钙支架上的培养结果（亚甲基蓝染色，19d） 左：静态接种；右：灌注法接种
Frank W. Janssen, et al., Biomaterials 27 (2006) 315–323
静态 负压
Lorenzo Soletti, et al., A seeding device for tissue engineered tubular structures, Biomaterials 27 (2006) 4863–4870
Athanasiou KA, et al., Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of PLGA. Biomaterials, 1996, 17: 93~102
【消毒方法】 (Ernst Magnus Noaha, et al., Biomaterials 23 (2002) 2855–2861) 材料 —— 胶原支架，固液相分离法制备，孔径20um 环氧乙烷法（EO）—— 100％EO蒸汽、70％湿度、55oC、7h； 40oC空气流中120h 60Co γ射线 —— 25 kGy（2.5Mrad）
2500rpm
细胞活力（总量）
单个细胞的活力
W.T. Godbey, et al., A novel use of centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds, Biomaterials 25 (2004) 2799–2805
10.2 影响细胞与支架复合的因素 10.2.1 支架材料的影响
不同方法所引起的PLGA75/25多孔支架体积和分子量的比较
方法 环氧乙烷
分子量变化 （%）
－12
体积变化 （%）
－50
灭菌效率（%） (n=10)
100
γ-射线
氩等离子体 （100W，4min）
70%乙醇水溶液
－54 ＋36
0
0
100
0
100
0
不定，一般 >70
消毒：disinfection；灭菌：sterilization
组织工程学
蔡晴
10
材料科学与工程学院
第 10 章 细胞与支架的联合培养技术
概述 —— 联合培养的用途和意义
1）评价支架材料对细胞的毒副作用； 2）考察细胞对支架材料的选择性； 3）研究细胞与支架材料的相互作用关系及其机制； 4）研究细胞接种在支架材料上的方法、数量、密度； 5）研究适合细胞生长，进行新陈代谢最佳材料结构，包括材料的组
【例】 将细胞分散在阳离
子胶原溶液中，用此溶 液充满支架孔隙，然后 在支架表面覆盖上阴离 子型的聚合物（如
PolyHEMA-MMAMAA）使之凝聚。
离心法
【方法】 将细胞悬液和支架装在试管中，放入离心机在设定
的转速下离心。
归一化的支架上的蛋白质含量
Yi-Chin Toh, et al., Application of a polyelectrolyte complex coacervation method to improve seeding ef.ciency of bone marrow stromal cells in a 3D culture system, Biomaterials 26 (2005) 4149–4160
D. Wendt, et al., Biotech. Bioeng., 84(2), 2003, 205-214
接种效率
接种细胞分布均匀性
软骨细胞在聚对苯二甲酸乙二醇酯支架上的接种比较
负压吸附法
【优点】 有利于细胞进入支架内部；细胞接种均匀；细胞接
种数量多；细胞接种率高。 【缺点】 负压吸引的压力不易掌握；容易污染。
样品发生体积 变化率（%）
灭菌效率（%） (n=10)
2
0
60
4
0
60
33
5
0
60
10
20a
70
2
0
60
3
0
80
100
4
0
100
5
20b
100
10
100c
100
注：a、10个样品中有2个体积收缩～48%；b、10个样品中有2个体积收缩～30%； c、所有的样品体积均收缩～50%。
Holy CE, Cheng C, Davies JE, et al. Biomaterials, 2001, 22: 25-31
¾ 细胞密度的影响
研究表明：低密度细胞不能形成关节软骨。
¾ 细胞代数的影响
组织工程化组织的构建以原代细胞为最好。
接种细胞的数量有限，接种率低，很多细胞被浪费。
接种法
【优点】 操作简便，可通过多次沉淀方法提高细胞的接种数量。
【缺点】 接种的细胞不均匀；易从筛网状支架的网孔中漏出，影
响细胞接种数量。
动态培养
【特点】 将支架浸没在高密度细胞悬液中，采用搅拌、震荡或旋
转培养系统，可使细胞更均匀、更多地附着在支架上。
【支架】用聚乳酸溶液将聚羟基乙酸纤维（直径12µm）排成的2mm厚无纺 支架粘连成型，孔隙率97％，支架密度50mg/cm3。
【种子细胞】平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs） 细胞悬液密度0.1～2×107 cells/ml
【接种方法】 静态接种——将50ml 细胞悬液（5 × 106 cells/ml）注射入PGA支架 搅拌接种——将PGA支架浸入40ml 细胞悬液（2 × 106 cells/ml）以 50rpm搅拌速度，于37oC下搅拌20h（在100ml烧瓶中进行） 剧烈扰动接种——将0.3ml 细胞悬液（2 × 107 cells/ml）注射入PGA 支架，装入试管，然后在100rpm水平摇床上晃动20h
单个细胞荧光强度
0rpm 100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
单个细胞荧光强度
100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
0rpm 100rpm 200rpm 300rpm 400rpm
J Biomed Mater Res 66A: 425–431, 2003
搅拌下接种
静态接种 搅拌接种
EO灭菌
射线灭菌
接种细胞后，支架的表面积随时间变化
MTT法细胞增殖活力
【结论】
γ射线消毒会引起胶原的断链，并引起支架的显著收缩，不利于后续的 细胞的培养。EO法对胶原支架的影响较小，但要注意的是：在支架消毒后 要在40oC的空气流中脱气至少5天后，才能使支架中的残留EO降到无毒水平 （7.69mg/g）。
¾ 支架的含水量
支架材料亲疏水性的影响 支架的预湿处理
¾ 支架的结构
孔的贯穿程度和孔径大小直接决定细胞能否进入支架内部。
¾ 支架材料的表面性质
材料的表面电荷、亲疏水性、化学组成、基团特性和表面几何 形状等都会对细胞的黏附和生长有重要影响。
10.2.2 细胞的影响
¾ 细胞对材料存在一定的选择性
研究发现：成纤维细胞和肌腱细胞在甲壳素材料上不能生长。
分子量 支架体积
重量
不同消毒方法对PLGA支架后续降解的影响 (■) 乙醇; (▲) 等离子体; (●) γ-射线；(*) 环氧乙烷
原始电纺无纺毡
Effects of sterilisation method on surface topography and in-vitro cell behaviour of electrostatically spun scaffolds，Biomaterials 28 (2007) 1014–1026