无机非金属材料扫描电镜的制样流程
扫描电镜制样
扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。
取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。
三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。
2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。
样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。
如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。
3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。
4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。
5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。
6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。
扫描电镜生物样品制备步骤
扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。
二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。
用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。
后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。
用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。
三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。
＊整个过程，样品不要暴露于空气。
1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。
四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。
五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。
用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。
玻片过大或者过厚影响观察效果。
2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。
3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。
离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。
样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。
4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。
将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。
（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。
5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。
扫描电镜样品的制备课件PPT教学
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗
➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品材料的生理值， 以免样品因环境突变而产生形变。
固定
➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
干燥
✓游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)；
粘样
（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。 样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率
镀膜 （6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、 组织液凝聚而影响观察效果。
镜检
通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力
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取材 三、固定方法
清洗 固定
1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
8000离心 2~5分钟
霉菌
切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌10 μm 酵母菌5 μm
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曲霉20 μm
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第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
简易剖出法
切断法：多孔组织 掰开法：实质性组织 拉断法：纤维组织
（1）植物材料：根部水冲洗去泥土，地上部用水冲洗或滴洗。 观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。
（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。
脱水 干燥
（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。 （4）游离细胞、微生物：离心法清洗。
清洗液与样品混合摇匀 低速离心（反复三次）
扫描电镜样品制备生物技术
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
无机材料测试技术10扫描电子显微镜
子称吸收电子。吸收电子的信号强度与背散射
电子的信号强度相反，即背散射电子的信号强 度弱，则吸收电子的强度就强，反之亦然，所 以吸收电子像的衬度与背散射电子像的衬度相 反。通常吸收电子像分辨率不如背散射电子像，
一般很少用。
思考题
电子与固体试样相互作用还有哪种方式？
透射电子
如果试样适当的薄，入射电子照射 时，就会有一部分电子透过试样。 其能量大小取决于试样的性质和厚 度。所谓透射方式就是指用透射电 子成像和显示成分分析的一种工作 方式。
引
言
扫描电子显微镜的简称为扫描电镜，英文 缩写为SEM (Scanning Electron Microscope)。 SEM与电子探针（EPMA）的功能和结构基本 相同，但SEM一般不带波谱仪（WDS）。它 是用细聚焦的电子束轰击样品表面，通过电子 与样品相互作用产生的二次电子、背散射电子 等对样品表面或断口形貌进行观察和分析。现 在SEM都与能谱（EDS）组合，可以进行成分 分析。所以，SEM也是显微结构分析的主要仪 器，已广泛用于材料、冶金、矿物、生物学等 领域。
弹性或非弹性散射作用，并激发出反映试样
形貌、结构和组成的各种信息，有：二次电 子、背散射电子、阴极发光、特征X 射线、 俄歇过程和俄歇电子、吸收电子等。
入射电子
Auger电子
背散射电子
二次电子
阴极发光 X射线
样 品
透射电子
各种信息的作用深度
从图中可以看出， 俄歇电子的穿透深 度最小，一般穿透 深度小于1nm，二 次电子小于10nm。
样品制备简单
样品可以是自然面、断口、块状、 粉体、反光及透光光片，对不导电的样 品只需蒸镀一层20nm的导电膜。 另外，现在许多SEM具有图像处理 和图像分析功能。有的SEM加入附件 后，能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等 动态过程的观察。
扫描电镜SEM制样步骤
扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。
冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。
每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。
Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。
粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。
SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。
参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。
扫描电镜样品制备
防止污染和氧化
保持清洁
在制样过程中，要保持样品和工具的清洁，避免引入污染物。
真空保存
将制备好的样品存放在真空环境中，以防止氧化和污染。
使用惰性气体
在需要的情况下，可以使用惰性气体（如氮气或氩气）来保护样 品，避免其与空气中的氧气或水分发生反应。
控制温度和湿度
恒温环境
在制样过程中，要保持恒定的温度，避免温度波 动对样品造成影响。
处理
对于某些难以清洁的样品，可以采用 适当的化学或物理方法进行处理，如 超声清洗、离子溅射等。处理后的样 品应保持干燥，避免受潮或污染。
02
扫描电镜制样方法
机械切割法
锯切
抛光
适用于较厚样品的初步切割，使用金 刚石锯片，注意控制切割速度和冷却 液的使用。
提高样品表面光洁度，常用抛光布和 抛光液，注意抛光时间和抛光液的选 择。
稳定性
样品在电子束轰击下应保持稳定， 不产生明显的形变或化学反应。
样品尺寸与形状
尺寸
通常要求样品尺寸在扫描电镜的 样品台范围内，一般直径不超过 30mm，厚度不超过5mm。
形状
样品形状应尽量规则，避免存在 尖锐边角或突出部分，以便于放 置在样品台上并保证成像质量。
样品表面清洁处理
清洁
样品表面应清洁无污物，避免尘埃、 油脂等杂质影响成像质量。
磨削
用于进一步减小样品尺寸和去除表面 粗糙度，可使用砂纸、砂轮等磨具， 注意选择合适的磨料粒度和冷却液。
化学腐蚀法
酸蚀
利用酸溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面氧化物和污染物，注意 选择合适的酸溶液浓度和腐蚀时
间。
碱蚀
利用碱溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面油脂和有机物，注意碱
扫描电镜实验步骤
扫描电镜实验步骤
扫描电镜是一种高分辨率的显微镜，可以用于观察微小的物体表面结构。
在进行扫描电镜实验时，需要按照以下步骤进行操作。
第一步：样品制备
样品制备是扫描电镜实验的关键步骤之一。
样品应该具有一定的厚度和尺寸，以便于在扫描电镜中进行观察。
通常情况下，样品需要进行固定、切片、染色等处理，以便于观察。
第二步：样品表面处理
在进行扫描电镜实验之前，需要对样品表面进行处理。
这是因为扫描电镜只能观察样品表面的结构，而不能观察样品内部的结构。
常用的样品表面处理方法包括金属喷镀、碳喷镀、真空蒸镀等。
第三步：扫描电镜操作
在进行扫描电镜实验时，需要将样品放置在扫描电镜的样品台上，并调整扫描电镜的参数，如电子束的加速电压、扫描速度、探针电流等。
然后，通过扫描电镜的探针扫描样品表面，将样品表面的结构转化为电子信号，并通过电子显微镜将其显示出来。
第四步：图像处理和分析
在获得样品表面的图像之后，需要对图像进行处理和分析。
常用的
图像处理方法包括增强对比度、去噪、调整亮度和对比度等。
而图像分析则可以通过计算机软件进行，如图像分割、形态学分析、三维重建等。
扫描电镜实验是一项复杂的实验，需要进行样品制备、样品表面处理、扫描电镜操作和图像处理和分析等多个步骤。
只有在严格按照实验步骤进行操作的情况下，才能获得准确的实验结果。
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无机非金属材料扫描样品的制备流程
样品要求：试样经切割和磨抛处理成适宜扫描电镜观察的大小后还应进行喷金或蒸碳处理，使其导电。
切割设备：沈阳科晶自动化设备有限公司生产适用于无机非金属材料切割的的金刚石线切割机的型号有STX-202A、STX-1202A、STX-202AQ、STX-603、STX-2401、STX-402、STX-2017种。
外圆切割机的型号有：SYJ-400、SYJ-200、SYJ-150、SYJ-160、SYJ-800、SYJ-506
种。
可根据材料的大小、切割的具体要求选择合适的切割设备。
耗材：金刚石线切割机用的各类直径的金刚石线、外圆切割机用的各类锯片、切割专用油、切割冷却粉、油石。
切割辅助设备：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的MTI-3040和MTI-250加热平台，设备操作简单，温度≤200℃。
耗材：陶瓷树脂衬垫、石蜡
试样的镶嵌：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的适用于无机非金属材料的冷镶嵌机的型号为CXQ-2500。
耗材：水晶胶、硬性冷镶模、软性冷镶模、弹性样品夹（冷镶嵌）
样品的磨抛：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的手动研磨抛光机型号有UNIPOL-820、UNIPOL-830、UNIPOL-1210三种。
自动精密研磨抛光机型号有UNIPOL-810、
UNIPOL-802、UNIPOL-1202、UNIPOL-1502四种。
自动压力研磨抛光机型号有
UNIPOL-1000D、UNIPOL-1200S、UNIPOL-1200M、UNIPOL-800M、UNIPOL-1260五种。
及
双面研磨抛光机UNIPOL-160D一种。
耗材：砂纸、金刚石磨片、树脂基金刚石磨片、研磨纸、研抛底片、磨料、抛光垫、抛光液、抛光膏、磁力橡胶
样品的清洗：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的超声波清洗机的型号有VGT-1620QTD、VGT-1620TD 两种。
等离子清洗设备的型号有PCE-6、PCE-8两种。
可根据样品自身的特性选择合适
的清洗方法。
样品表面喷金和蒸碳：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的GSL-1800X-ZF2小型蒸镀仪，VTC-16-3HD 3溅射蒸镀膜仪是电镜实验室喷金和蒸碳常用的最佳设备。
耗材：靶材
样品观察：将已经导电的试样用导电双面胶粘接到载样台上之后就可以用扫描电子显微镜进行观察了。
以上设备和对应耗材沈阳科晶自动化设备有限公司均有销售。
碳化硅陶瓷样品MTI 加热平台SYJ-200外圆切割机
或金刚石线切割机
HXQ-50
自动热镶嵌机UNIPOL-810精密研磨抛光机PCE-6V 小型等离子清洗机VTC-16-3HD 3小型蒸镀仪场发射扫描电子显微镜样品经加热平台加后粘结在样品台上粘结好的样品经外圆切割机切割成合适大小的试样切割后的小样品经镶嵌设备镶嵌镶嵌后的试样经磨抛设备研磨成光亮的表面抛光后的试样经等离子清洗干净将不导电的试样进行喷金处理将处理好的样品用扫描电镜进行观察样品放在加热平台
上加热
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