western blot操作规程-相关试剂配制
Western blot 试剂与操作步骤
[主要试剂]1、SDS-PAGE 试剂：2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O 至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。
7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。
[操作步骤]1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g 离心15min。
取上清液作为样品。
2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。
转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
western-blot-相关试剂及步骤
western-blot-相关试剂及步骤western-blot-相关试剂及步骤Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL 离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）:1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF 解冻2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。
每管研磨的转速和时间保持一致。
当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm，4摄氏度，30分钟6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。
前者用于测试，后者备用。
-80摄氏度冻存。
注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）：（一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液（二）步骤1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。
western blot 操作流程
Western blot protocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1. Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2. PMSF（100mM）：sigma；3. PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF，混匀。
冰上保存数分钟待用；2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液，将培养瓶置于冰上；3. 加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（107个细胞加入Western及IP细胞裂解液1 mL～2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5 min（离心机需要预冷）；5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融。
（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2. 取一块96孔板，按照下表加入试剂：3. 把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。
以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。
Western Blotting操作步骤及说明
Western Blot操作方法及步骤1).蛋白质提取Extraction buffer组成:蔗糖0.7 MTris/HCl0.5 MEDTA 50 mMKCl0.1 M配制成母液pH 9.4巯基乙醇2%蛋白酶抑制剂25×取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中），加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；向两只EP管中各加入1 ml 0.1M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；用0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；室温干燥蛋白, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。
2). 测定总蛋白浓度。
用BCA蛋白检测试剂盒测定提取物中的蛋白质含量(1)蛋白浓度测定1、考马斯亮蓝G250通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。
蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子，从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色①测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度BSA原液浓度：5mg/ml②待测样品稀释用Nanophotometer（纳米光度计）初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。
③加样准备测定标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中，加入BCA工作液200μl。
Westernblot实验技术
Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。
贮存液保存于室温。
3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。
4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。
5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。
6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。
Western_blot_试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。
2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
使用时稀释成1X。
2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。
Western 步骤
Western blot规范化操作步骤1、主要试剂配制2、操作步骤（1）细胞总蛋白提取1）收集细胞，冰预冷PBS洗两遍2）加入适量细胞裂解液（50-100uL），涡旋混匀冰上放置5min3）超声破碎细胞（程序化）4）超声后，在4℃，12000rpm离心10min。
收集上清，即为总蛋白裂解物（2）检测蛋白浓度1）使用BCA法检测蛋白浓度2）调整样品浓度一致3）加入蛋白4×loading buffer，煮沸20min，冷却后-20℃保存（3）SDS-PAGE电泳根据目的蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶（根据图1确定分离胶浓度），5%的浓缩胶，蛋白上样量一般为25-40ug（根据目的蛋白表达水平调整上样量）。
电泳以恒压进行，浓缩胶电压80V（约30min），待蛋白进入分离胶后，改变电压至120V。
待溴酚蓝行进至分离胶下缘时停止电泳（1-1.5h）。
（4）湿式转膜1）电泳结束前准备合适大小的PVDF膜（甲醇浸泡2-3min，活化正电基团，肉眼观察膜表面无白色点状或块状区域存在后，置于电转缓冲液至少15min待用）或硝酸纤维素膜（NC膜，浸泡于蒸馏水10min，平衡离子强度）。
准备适合大小的滤纸浸泡于电转缓冲液备用。
电泳结束后，小心撬开玻璃板，用切胶器将上层浓缩胶剥去，将凝胶转移至电转缓冲液中。
2）在电转缓冲液中按照以下顺序制作三明治:海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵（厚海绵，压缩滤纸上下各一块或薄滤纸上下各3层，电转板白色部分在下方），对齐，用玻璃棒赶走气泡。
3）将电转板放入电转槽中(黑色对着黑色面)，浸泡在电转缓冲液中，冰浴中以200mA恒流电转2h（分子量较大的可以延长转移时间）。
电转结束后，将PVDF 膜（或NC膜）放在丽春红染液中染色3-5min，观察蛋白转移情况后，根据蛋白大小在合适位置剪膜（在一抗孵育前，勿把膜完全分离），然后用TBST缓冲液将染料洗去。
（5）封闭将PVDF膜（或NC膜）置于封闭液中（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液），室温晃动1h（85rpm。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western Blot操作步骤
一、细胞蛋白的抽提6孔细胞培养板中细胞培养液弃去，加入80ul 1×loading buffer，置冰上用刮刀刮匀，吸入EP管煮沸5min。
冷却后12000rpm低温离心5min，上清分装冻存（27ul/支）。
二、Western blot 试剂配方（一）母液1、1 mol/L Tris.HCl pH HCl mlTris 30.29g 7.4 17水200ml * 7.5 16 浓盐酸调pH，完后加H2O定容至250ml. 7.6 158.0 102、10% SDSSDS 10g水100ml 50℃水浴溶解3、10% 过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g水 1.0ml 4.℃保存,1周内使用.4、1.5mol/L Tris.HCl（pH 8.8）Tris 45.43g水200ml浓盐酸调pH.至8.8，完后加H2O定容至250ml.5、1.0mol/L Tris.HCl（pH 6.8）Tris 30.29g水200ml浓盐酸调pH.至6.8，完后加H2O定容至250ml.6、30%聚丙烯酰胺丙烯酰胺14.55g甲叉双丙烯酰胺0.45g水20ml搅拌后加水到50ml 、棕色瓶４℃保存（１个月／更久）7、20%Tween 20Tween 20 20ml加水至100ml，４℃保存.8、TEMED 直接取用9、G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95%乙醇50ml磷酸100ml加水至1000ml注：乙醇先溶解，再加磷酸、水，混匀后过滤，４℃保存。
（二）胶的配制（现配）10% 12%（常用）分离胶（μl）5% 浓缩胶（μl）水4000 3300 270030%丙烯烯酰胺3300 4000 6701.5M Tris.HCl（pH 8.8）2500 1M Tris.HCl（pH 6.8）50010% SDS 100 4010% AP（最后加）100 40TEMED（最后加） 4 4步骤：1、分离胶灌胶至离梳子下缘1cm左右，上覆水100~200μl，30~60min聚合；2、用滤纸吸去水，配浓缩胶，灌入，插入梳子，注意赶净气泡，约30min聚合；3、放入电泳液中，拔去梳子。
western blot试剂配方
Tris (MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
Ph
Hcl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
（5）10%SDS
SDS
10g
蒸馏水至
Western blotting所需要试剂配方
1、超纯水
2、30%Acr/Bic(29.1)、1.5mol/L Tris.Hcl(Ph=8.8)、0.5mol/L Tris.Hcl(Ph=6.8)、1.0mol/L Tris.Hcl、10%SDS
3、10%AP(使用前加1000ul超纯水)、转移缓冲液、TBS、TBST、TEMED、甲醇、吐温20
5.8g*10
SDS
0.37g*10
甲醇
200ml*10
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（8）TBS缓冲液
1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）
10ml
NaCl
8.8g
蒸馏水至
1000ml
可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用
（9）TBST缓冲液
20％Tween20
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用，最好现用现配
（10）电转缓冲液
Tris（MW121.14）
3.03g
甘氨酸（MW75.07）
Western Blot配方与方法
Western Blot配液：1.10% SDS溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH2O1ml加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。
2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH2O 1ml由于过硫胺酸会缓慢分解，最好新鲜配制，或隔周配制（也可每200微升EP分装，4℃保存4W，-20℃保存1月）3.1×电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至1000ml，调整PH 8.3。
冰箱内可保存数月。
4.10 ×转膜液（储存液）甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH2O 400ml加水至500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。
1 ×转膜液 1L配制：10 ×转膜液储存液100ml，150ml甲醇，加DDH2O 750ml，PH 8.5，定容至总量1L5. 1 ×转膜液（现配现用）：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至1000ml6.10 ×TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整PH至7.6后定容至500ml7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml配胶：先配分离胶，再配积层胶。
一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶，而积层胶放4℃，等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。
（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29配制时，SDS-PAGE有效分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。
Western blot实验流程
Western blot一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。
二.药品配制：1.TBS×10(Tris Buffered Saline)：2.42 g Tris base8g NaCl100ml H2O, 用HCl调pH 7.6，4°C保存.(配TBST用)TBST=TBS+0.05%Tween 2．TBS：0.303 g Tris base0.4383g NaCl (150mM)0.05gSDS用HCl调pH至8.0(配裂解液用)，50ml约用2.1mlHCl。
3．0.5M Tris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4℃保存。
(若调小了，用5.6%NaHCO3调回) 。
1.5M Tris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4℃保存。
4．5×Running buffer pH8.3,500ml：Tris-base 7.5g,Glycine(甘氨酸) 36g,SDS 2.5g加灭菌水至500ml, 4℃保存,用时若有沉淀析出可提前拿出置37℃，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Running buffer加入240ml水。
5．30%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：8.76g acrylamide, 0.24g N, N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml 。
用0.45 µm的过滤器过滤后4°C避光保存6．10%SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶，需较长时间)，常温保存。
自己根据实验总结的Western blot
Western blot一、试剂配制1）细胞裂解液：用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。
2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。
PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。
pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。
4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。
5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。
6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。
注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。
8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。
9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。
(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western-blot实验所需试剂配制方法
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 18.17 80ml 2.8-3ml
--
色瓶中 4℃保存，
（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）
2. 10％（W/V）过硫酸铵：
名称
用量 备注
过硫酸铵
0.1g
去离子水
1ml
现配现用
（注意：10％过硫酸铵溶液在 4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）
3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 1MTris-HCL, pH=6.8 SDS 甘油 BPB（溴酚蓝） 超纯水
2ME
用量
1.25ml 0.5g 2.5ml 25mg 至 5ml 50℃充分溶解， 30min，离心取上 清，0.45uM 过滤 10ul/200ul
2.5ml 1g 5ml 50mg 10ml
备注
分装 200ul/管 使用前添加，添加后可室温 保存一个月
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
备注 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
ห้องสมุดไป่ตู้--
--
缓冲液配置：
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
8SDS-PAGE电泳适用与Bio-Rad Mini Protean 3类电泳槽一、准备工作1 试剂蛋白marker；丙烯酰胺；双丙烯酰胺；Tris碱；甘氨酸；甲醇；冰乙酸SDS；过硫酸铵；甘油；溴酚蓝；β-巯基乙醇；考马斯亮蓝R-250；TEMED；正丁醇2仪器与耗材电泳系统；移液枪；电子天平；pH计；恒温加热器；EP试管；量筒（500ml,250ml,100ml,20ml）；烧杯（500ml,50ml）；玻璃引流棒；储液瓶；二、操作步骤a.灌制分离胶(6cm×8cm×1.5mm):1. 组装好凝胶模具，确保不会发生凝胶渗漏。
2. 凝胶配制所用组分如下：按10%配制（注：先加入○1○2○3○4，然后再从冰箱取出○5○6加入）3. 加入○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。
（注：一定要将加入的溶液充分混匀，以免胶凝固的不均匀）4. 小心地用移液器将分离胶沿隔片加入模具。
（注：动作缓慢，以免产生气泡）5. 当加入的凝胶溶液7.4 mL时，轻轻在溶液上覆盖一层1 mL正丁醇饱和的水，使胶面平整。
6. 等40 min，待凝胶聚合后，在分离胶和水之间会出现一个清晰的界面。
（注：此时可制备蛋白样品。
具体见“c. 样品的制备”）b. 灌制浓缩胶1.浓缩胶配制所需组分如下：按3.9%配制2.倒出并用滤纸吸干覆盖在分离胶表面的水层。
（注：先加入○1○2○3○4，然后倒出水，最后再从冰箱取出○5○6加入）3.加入○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。
4.小心地用移液器将浓缩胶沿隔片加入模具，直至凝胶到达模具的顶部。
5.斜着插上梳子。
（注：动作缓慢，尽量不要产生气泡）6.放置30 min左右，待凝胶聚合后，小心拔出梳子。
（注：拔出梳子时，要垂直拨出，以免损坏制好的泳道）7.将凝胶放入电泳槽中，在槽中加入1×电泳缓冲液。
（注：1，缓冲液所加入的量，○1玻璃内液面高于玻璃外液面，○2玻璃内的，液面高于短玻璃低于长玻璃。
2，尽量吸尽玻璃内液面的气泡，以免电泳过程中造成短路）c. 样品的制备：1.将蛋白样品和sample buffer在一1.5 mL管中混匀，于95℃加热5 min（或100℃ 3 min）。
2.离心1 sec，点样入泳道。
d. 电泳：1.接好电极，电流应流向阳极。
2.150 V恒压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部1～5 mm处终止。
时间约60-75min。
（注：此时○1配制电转缓冲液，○2剪NC膜和滤纸）3.取出凝胶板，小心拆卸。
e. 染色与脱色：（注：此步骤按实验需要选择是否操作）考马斯亮蓝染色：1.戴上手套以免手指印留在胶上，将胶移入考马斯亮蓝溶液中，于振荡摇床上缓缓振荡染色2 h以上（一般3～4 h），染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器。
2.加入考马斯亮蓝脱色液，振荡脱色。
Western blot操作过程一、准备工作：1 试剂：Tris碱；甘氨酸；甲醇；预染marker (PRO-STAINTM Prestained Protein MarkerⅠ, mbi)Whatman滤纸（普通实验室用的不行，要厚的，夹膜用的）一抗；二抗；Western试剂盒(170-5013, Bio-Rad)；硝化纤维膜(Amersham)；X光片(最好是柯达的)；显影粉（国产，洗普通照片的即可）；定影粉（国产，洗普通照片的即可）；2 仪器及耗材：膜标记笔；电转系统；冷却系统；磁力搅拌器；水平脱色摇床；锥型瓶（50ml,2个）；托盘；保鲜膜；二、操作步骤（除非特别提到，以下操作均在室温水平摇床上缓缓振荡进行）：1.SDS-PAGE变性电泳；2.电转移：a．将电转用到的膜和滤纸（1张膜+6张滤纸/一块胶）浸泡在电转缓冲液中10min。
（注：此时将分离胶从玻璃板中取出并浸泡到电转缓冲液中）b．按3张滤纸—胶—膜—3张滤纸的顺序包好，并将滤纸四边按胶的大小剪掉，确保胶两边的滤纸无法接触到。
C．将包好的胶放入转移胶架中，（原则：膜白胶黑）。
然后将胶架放入电转槽中。
（原则：黑对黑，白对红）d．倒入电转缓冲液，放入冰盒和磁转子。
将电转槽放到磁力搅拌器上，放入冰箱。
e．进行电转：350mA恒流，时间75min。
（注：此时○1配制TTBS,1×TBS;○2配制Blocking buffer；○3配制一抗和二抗并放入冰箱）3.洗膜：1×TBS 20 mL，5 min×2次。
（注：膜的触胶面为正面向上放置）4.封闭：Blocking buffer 20 mL，1 h。
5.洗膜：TTBS 20 mL ，5min×3次。
6.孵育一抗：15mL一抗，1.5h。
7.洗膜：TTBS 20 mL ，5min×3次。
8.孵育二抗：15mL一抗，1.5h。
（注：此时配制显影液和定影液）9.洗膜：TTBS 20 mL，5min×3次。
（注：此时配制发光底物）10.将膜上多余的水分去尽，摊到事先铺好的保鲜膜上。
11.化学发光底物与膜反应5min（注：反应过程中要保持膜湿润，并浸没在发光底物中）。
12.控去膜上水分（不要干），保鲜膜包好，四周要留些边。
用透明胶将其贴在X光片夹中。
13.暗房内在X光片上曝光30 sec，1 min，10 min，1 h。
14.将X光片在显影液中摇晃，直至X光片上出现并达到合适黑度。
15.X光片清水中漂洗片刻，放入定影液20 min，自来水漂洗2 h以上，晾干。
Western blot 所需试剂蛋白提取所用试剂：蛋白提取液：Hepes 、二硫苏糖醇（DTT）、胃蛋白酶抑制剂、亮肽素、antipain（抗痛素）、PMSF溶剂：KOH、异丙醇、甲醇SDS-PAGE电泳所用试剂：丙烯酰胺、双丙烯酰胺、SDS 、Tris-base 、APS 、甘氨酸、β-巯基乙醇、甘油、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250 、冰乙酸、TEMED、预染Mark 溶剂：HCl电转所用试剂：NaCl 、Tween-20 、脱脂奶粉、NC膜、whatman滤纸蛋白含量测定所用试剂：考马斯亮蓝G-250 、85% 磷酸、95% 乙醇显影所用试剂：定影液、显影液、保鲜膜、X光片、剪刀、直尺、铅笔、计时器Acrylamide/Bis (30% T, 2.67% C)：丙烯酰胺58.4 g (29.2 g/100 mL)双丙烯酰胺 1.6 g (0.8 g/100 mL)纯净水定容至200 mL，过滤，于4 °C下黑暗保存，戴手套操作，操作尽量避光10% (w/v) SDS：戴口罩，风扇关将2 g SDS加入18 mL dd H2O中，轻柔搅拌溶解后，用dd H2O定容至20 mL。
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8：Tris base 27.23 g (18.15 g/100 mL)dd H2O 80 mL用6 N HCl 调pH 值至8.8。
用dd H2O定容至150 mL，并于4 °C存放。
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8：Tris base 6 gdd H2O 60 mL用6 N HCl 调pH 值至6.8。
用dd H2O定容至100 mL，并于4 °C存放。
1M Tris-HCl, pH 6.8:Tris base 6gdd H2O 30ml用6 N HCl 调pH 值至6.8。
用dd H2O定容至50mL，并于4 °C存放电泳缓冲液母液Electrode Buffer, 10×，pH 8.3 (1 L)：Tris base 30.3 g甘氨酸144.0 gSDS 10.0 g溶解后，用dd H2O定容至1,000 mL (不要用酸或碱调pH 值)。
电泳工作液：将90 mL of 10×母液用810 mL dd H2O稀释，并完全混匀。
电转缓冲液：Tris 3.03 g甘氨酸14.4 g甲醇200 mL 加dd H2O至1000 mL。
测定其pH一定要大于8.0, 否则重配，不要加HCl调节pH。
4℃备用。
Stock Sample Buffer 母液，5×: （用于配置蛋白样品）1 M Tris-HCl, pH 6.8 12.5 mL (sterile)甘油25 mL (sterile) (高压灭菌)SDS 1 g溴酚蓝12.5 mg混匀，并充分溶解，室温保存。
Reducing Sample Buffer 工作液：5×SDS Reducing Sample Buffer(现配现用) β-巯基乙醇(β-Me) 30 µl5×SDS Stock Sample Buffer 100 µl混匀，并充分溶解，室温保存。
上样蛋白配置：（30ul 体系）5×SDS Reducing Sample Buffer 6 µl蛋白样50ug裂解液补体系至30ul混匀，95 °C 加热5 min，室温冷却后加入样品井中。
10× TBS 母液（1 L）：Tris 24.2 gNaCl 80 g 加HCl调节pH 至7.6 。
1× TBS 工作液：取10× TBS的50ml，加水定容至500ml10% APS (现配现用)：（一周失效）Wash Buffer（TTBS）(现配现用):1× TBS 400mlTween-20 400ulBlocking Buffer 封闭液(现配现用):TTBS 20mlnonfat dry milk 1gAntibody Buffer (现配现用): (一个抗体用15ml antibody buffer)TTBS 15mlnonfat dry milk 0.03g考马斯亮蓝染色液（1 L）：考马斯亮蓝R-250 1.0 g甲醇450 mLddH2O 450 mL搅拌2 hr直至完全溶解，然后加入冰乙酸100 mL混好溶液后，过滤，用棕色瓶(empty "methanol" or "ethanol" bottle)盛装，室温下保存。
凝胶应在RT下缓缓振荡染色2 h以上。
染色液反复使用不可超过3次。
考马斯亮蓝脱色液（1 L）：甲醇100 mL冰乙酸100 mLdd H2O 800 mL蛋白含量测定Stocking Reagent（原液）：考马斯亮蓝G-250 1g85%磷酸200ml95%乙醇100ml将混合物于磁力搅拌器上搅拌溶解，至完全溶解为止（需2 h以上），然后，过滤溶液，溶液密封存放于旧的棕色乙醇瓶中，4℃放置（可长期存放）。
蛋白含量测定Working Reagent（工作液）：即DyeStocking reagent 15ml85%磷酸40ml95%乙醇20mlddH2O 加至总体积为400ml将溶液混匀后，过滤，溶液密封存放于旧的棕色乙醇瓶中，4℃放置（可放置数周）。