HPLC方法开发——流动相的选择
高效液相流动相缓冲盐选择
高效液相流动相缓冲盐选择Final revision by standardization team on December 10, 2020.下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。
对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。
考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH 单位。
当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如和缓冲盐溶液），可提供最好结果。
对流动相的优化主要体现在水相上。
流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。
如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。
如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。
（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。
了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。
缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。
HPLC方法开发流动相的选择
和减小水的表面张力。 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶
液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点， 重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于 混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不 含盐流动相；
10
9. 梯度洗脱
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的 组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于 分析组分数目多样品。
优点：
缩短分析时间 提高分离度 改善峰形 提高检测灵敏度
缺点：
增加基线漂移 较长平衡时间
精品课件
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9. 梯度洗脱
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变 化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱 的流动相。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出
HPLC方法开发
——流动相的选择
精品课件
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1. 流动相的一般要求
流动相对样品具有一定的溶解能力 流动相具有一定惰性 流动相应不改变填料的任何性质 纯度高 流动相的黏度要尽量小 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 流动相沸点不要太低 应选用挥发性溶剂 流动相配置好后要进行过滤 流动相配制好后要进行脱气
项目 电阻率，MΩ·cm，25℃，最小 总有机碳（TOC)，mg/L，最大 微粒，µm滤器
指标 18.0 0.5 0.22
• HPLC级水增加紫外加吸收要求： 在1cm池中，用HPLC级水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度
反相色谱流动相的设计
• 疏水性增强 • 更强保留
• 疏水性减小 • 更弱的保留
• 疏水性增强 • 更强保留
• 疏水性减小 • 更弱的保留
31 分子的离子化状态可以由流动性的pH值决定。因此，流动性的pH值能影响具有 离子化基团的分析物的保留性能
pH值对分析物的影响
32
pH值对分析物保留行为的影响
碱化
H+
酸化
烷烃类键合相 33
这很可能是因为乙腈氰基上pi电子影响了分析物上的pi电子和 固定相苯环上的pi电子之间的作用，而甲醇不会有这样的影响。
甲醇在氢键作用下既是强 的质子给予体又是质子接 受体
乙腈上的氰基会干扰固定 相苯环与分析物分子之间 的pi-pi作用
H3C OH
N
CH3
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苯基色谱柱溶剂的选择
色谱柱:
流动相: 流速: 化合物:
0
1
2
3
4
min
•整体技术载体 •对生物样品接受度高 •Rs 1&2 = 1.35 •背压 = 86 Bar
•塔板数 = 13800
MWD1 A, Sig=220,8 Ref=off (ZA04061A\STEONYX2.D) mA U
100
Onyx™ C18
80
1
2
60
40
20
1.497 1.567
2.485 2.956
3.617
4 3
Area: 209.386 5
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0
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2
3
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min
固定相选择性对分离度的影响回顾5
推荐的固定相选择必备工具:
1、反相色谱柱选择终极指南画报 2、反相色谱柱选择终极指南画册 3、反相柱筛分工具
液相方法开发波长选择
液相方法开发波长选择
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，特别是在药物开发和质量控制中。
开发HPLC的方法涉及多个方面的选择与优化，其中波长的选择是非常关键的一步。
1. 找到目标化合物的峰：首先需要确定目标化合物的吸收波长。
这通常可以通过文献查阅或实验来确定。
2. 色谱柱的选择：原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，因此需要选择具有较高理论塔板数的色谱柱，以提供更好的分离度。
3. 流动相的选择：流动相pH、有机溶剂等是影响选择性的重要因素，需要进行筛选。
4. 检测波长的选择：在确定了目标化合物的吸收波长后，还需要进一步调整以获得最佳的峰形和分离效果。
5. 梯度的优化：除了固定波长外，还可以考虑使用梯度洗脱来进一步提高分离效果。
6. 方法验证：在确定了最佳的色谱条件后，还需要进行方法验证，确保所选的条件能够稳定、可靠地运行。
总的来说，液相方法的开发是一个系统性的过程，需要结合理论知识和实践经验，通过不断的试验和优化来确定最佳的色谱条件。
流动相的选择技巧
流动相的选择技巧LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】流动相的选择技巧常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。
对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。
流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。
一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。
相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好，从图中可以看出多数样品在低pH值下峰形都比中性要好，这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。
色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖尾，一般认为硅羟基的pKa在到之间，低pH值能帮助抑制硅羟基的活性，减小拖尾，从而改善峰形，提高分离度。
HPLC分析方法开发与验证
HPLC分析方法开发与验证HPLC（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，广泛应用于药物研发、环境监测、食品检测等领域。
本文将从方法开发和验证两个方面介绍HPLC分析方法。
一、方法开发方法开发是确定分析物检测条件的过程。
以下是HPLC方法开发的步骤：1.确定分析目标：确定待分析的物质以及其化学性质，如分子量、分子结构等，以便选择正确的色谱柱和检测方法。
2.选择色谱柱：根据分析物的特性选择合适的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3.优化流动相：选择适当的流动相组成，如有机溶剂和缓冲液的混合物，以实现分离效果的最大化。
4.优化柱温：通过改变柱温度来控制分析物的保留和分离，可以提高分离效果和峰形。
5.选择检测波长：根据分析物的特性选择最佳的检测波长，以最大化检测灵敏度和选择性。
6.确定流速和进样体积：通过改变流速和进样体积来优化分离效果和检测灵敏度。
7.优化pH值：对于离子化合物，通过改变缓冲液的pH值可以改变分离效果。
8.创建方法文件：根据上述优化结果，建立最终的分析方法文件，记录分析条件和步骤。
二、方法验证方法验证是确保分析方法可靠和准确的过程，以下是HPLC分析方法验证的主要内容：1.线性范围：检测浓度在一定范围内的线性关系，通过测定不同浓度的标准品并绘制标准曲线来确定。
2.精密度和重复性：通过重复测定样品的相对标准偏差（RSD）来评估分析方法的精密性。
3.准确度：通过添加已知浓度的标准品到已知浓度样品中并测定含量，评估分析方法的准确性。
4.特异性：分析物是否受其他物质的干扰，通过对混合标准溶液进行测定来评估色谱方法的特异性。
5.检出限和定量限：标准曲线下限和浓度下限的浓度，测定方法的灵敏度。
6.系统适应性：测试HPLC仪器系统的重复性和稳定性，包括波长准确性、峰对称性和分离效果。
7.样品稳定性：评估样品在一定时间和条件下的稳定性，包括溶液稳定性和冷冻/解冻稳定性。
HPLC分析方法的建立与开发
.
23
2、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，
表示溶剂的洗脱能力越大。
序号 1
溶剂 异辛烷
紫外波长极限 （nm）
197
序号 9
溶剂 氯仿
紫外波长极限 （nm）
245
2
正己烷
190
10 二氧六环
215
3 甲基叔丁基醚
记住∶ 每次改变一个参数
❖ 调节α值改变选择性
❖ 调节柱长度改变柱效及分. 离速度
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使用文献方法注意点
❖ 色谱柱填料的种类、品牌是否相同?
❖ 注意文献方法的流动相
是否损害色谱柱?
如色谱填料品牌不同，需要调整流动相
❖ 注意色谱柱的规格：内径、柱长
需要调整流速、进样量
❖ 注意梯度条件
❖ 了解系统的滞后体积（梯度）
正相色谱的定义：在极性的固定相上，用极性较小的
液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相
色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性
.
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正相色谱和反相色谱
正相色谱和反相色谱的差别： 正相色谱
反相色谱
固定相极性
大
小
流动相极性 组分流出顺序 流动相极性增大
分离组分
小至中等
中至大
极性小的组分先流 极性大的组分先流
1、确定样品是属于常规的还是特殊的
特殊样品包括：
无机离子
对映体
生物分子
合成的高分子
碳水化合物
异构体
.
48
2、选择分离条件，进行第一次分离
分离变量 柱填料 柱结构 流速 流动相
HPLC分析方法开发典型思路经验小结
HPLC分析方法开发典型思路经验小结高效液相色谱方法的开发是一个繁复的过程，但不管再繁复，也有其规律可寻。
方法开发过程中，一个总的原则是：先找到目标化合物的峰，然后调整峰形，再是进一步完善。
一、找到目标化合物的峰要找到目标化合物的峰，我们该如何开展工作，先举一个例子，下面是分析氟康唑氯化钠注射液的一个谱图：谱图上的内容主要包括：色谱柱、波长、流动相、温度、流速和进样量这几项。
这意味着如果这几个色谱条件都确定下来了就可以基本认为这个方法已经开发成功，所以开发方法时我们可以通过逐一的考查这几个色谱条件来进行。
考查色谱条件是需要通过在色谱仪上进样来进行的，这就需要我们首先确立一个初始条件，即回答从何开始的问题。
在回答好“从何开始”这个问题之前，我们先要了解我们的被分析物，就像一场战争，首先要知道自己的敌人是谁一样，我们要了解它的物理、化学性质，特别是化学结构式非常关键。
所以，色谱方法开发工作可以通过如下的步骤来展开：1、收集资料对它的分子量、结构式，以及在水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、正己烷和异丙醇中的溶解度有一个初步的了解。
对分子量的了解在选择色谱柱的过程中是非常重要的，因为色谱柱填料的孔径对化合物的分离具有重要的影响。
填料孔径对分离度和峰形是有一定影响，120A的色谱柱通常适用的范围为分子量<10000的，如果分子量太大，在填料为120A孔径的柱子上分离度会比较差，因为样品分子在色谱柱上有较好的保留是由于可以进入到填料的微孔里面，与键合在表面上的C18长链相互作用，通常孔径直径需要大于分子直径的3倍以上才不会对分析造成影响。
因此一般分子量10000一下的化合物建议用120A 的柱子来分析，分子量大于1W小于20W的用300A的来分析，分子量大于20W 的就要用凝胶柱了。
结构式对于分子极性大小的预测以及后续调整峰形时具有非常重要的作用，如－COOH、－NH2、－NHR、－NR2、－OH等都是极性基团，而苯环、己环、－CH＝、－CH2－CH3等都是非极性基团，根据经验大致对其极性做一下判断，估计一下可能在C18上（用得最多，我们最熟悉）的保留性能如何，再结合目标化合物在上述所说的几种溶剂中的溶解度状况，对方法开发时可能用正相柱还是反相柱来作一个粗略的判断，以及方法开发完成后的认证有作用。
hplc 方法开发流程
hplc 方法开发流程HPLC方法开发流程HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析方法，广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域。
开发一个有效的HPLC方法是保证分析准确性和可靠性的关键步骤。
本文将介绍HPLC方法开发的基本流程。
第一步是确定分析目标。
在开发HPLC方法之前，需要明确要分析的目标物是什么。
这可能是一种药物成分、环境中的某种化合物或食品中的营养成分等。
确定目标物的性质和特征对于后续的方法开发至关重要。
第二步是选择适当的色谱柱。
根据目标物的性质，选择合适的色谱柱是至关重要的。
常见的色谱柱有反相柱、正相柱、离子交换柱等。
选择合适的色谱柱可以提高分离效果和分析速度。
第三步是优化流动相。
流动相的组成对于HPLC分离的效果有很大影响。
在这一步中，需要选择合适的溶剂和添加剂，并优化它们的浓度和比例。
同时，还要考虑流动相的pH值，以保证分析目标物在色谱柱上有良好的保留和分离效果。
第四步是确定最佳的进样条件。
进样是样品在HPLC中进行分析的重要步骤。
确定最佳的进样条件可以提高分析的准确性和灵敏度。
在这一步中，需要考虑进样体积、进样方式和进样速度等因素。
第五步是优化检测条件。
检测器是HPLC中的关键设备，能够提供分析目标物的信号。
在这一步中，需要优化检测器的参数，如波长、灵敏度和线性范围等。
同时，还需要选择合适的检测器类型，如紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
第六步是验证方法的准确性和可靠性。
在开发HPLC方法之后，需要对其进行验证。
验证方法包括评估方法的线性范围、灵敏度、精密度和准确度等。
通过验证可以确保方法的可靠性和可重复性。
最后一步是编写分析方法报告。
在完成HPLC方法开发和验证后，需要撰写详细的分析方法报告。
报告应包括分析目标、色谱条件、进样条件、检测条件以及方法的准确性和可靠性验证结果。
报告的编写应遵循科学的逻辑和规范，以便他人能够复制和验证该方法。
总结起来，HPLC方法开发流程包括确定分析目标、选择适当的色谱柱、优化流动相、确定最佳的进样条件、优化检测条件、验证方法的准确性和可靠性以及编写分析方法报告。
HPLC固定相与流动相
复杂样品中各种组分的方法。
02
它利用不同物质在固定相和流动 相之间的分配平衡进行分离，通 过检测器检测各个组分的性质和 含量。
HPLC的原理
高效液相色谱法基于物质在固定相和 流动相之间的分配平衡进行分离。
不同物质在固定相和流动相之间的分 配系数不同，因此通过色谱柱时，会 按照一定顺序流出，从而实现分离。
流动相以避免干扰。
测需求选择合适的固定相和流动相组合。
05 HPLC固定相与流动相的 优化
优化分离效果
01
02
03
选择合适的固定相
根据待测物质的性质，选 择具有适宜极性、选择性、 稳定性和寿命的固定相， 以提高分离效果。
调整流动相组成
通过调整流动相的组成， 如改变溶剂类型、比例和 pH值，可以改善分离效果。
固定相的选择
根据化合物性质选
择
对于不同极性和性质的化合物， 应选择具有相应极性和功能基团 的固定相。
根据分离要求选择
根据分离要求，如分离度、分析 时间等，选择具有合适粒度和性 能的固定相。
实验验证
在实际应用中，对固定相的选择 应进行实验验证，以确保其性能 和分离效果符合要求。
03 HPLC流动相
控制温度
适当升高温度可以提高流 动相的流速和降低黏度， 有助于提高分离效果。
提高检测灵敏度
选择高灵敏度检测器
根据待测物质的性质，选择高灵敏度的检测器，如紫 外、荧光、电化学检测器等。
优化检测波长
选择合适的检测波长可以降低背景干扰，提高检测灵 敏度。
降低样品浓度
通过优化样品处理和稀释方法，降低样品浓度，可以 降低检测限和提高灵敏度。
流动相的组成和性质也会影响分离效果。例如，使用不同的有机溶剂或 混合溶剂可以改变流动相的极性和粘度，从而影响物质在固定相上的吸 附和解析能力。
反相色谱中流动相选择的最新趋势和最佳操作
反相色谱中流动相选择的最新趋势和最佳操作反相液相色谱（RP-HPLC）在用于定量分析的高效液相色谱（HPLC）中占主导地位，它被用于80%的HPLC应用中（1-3）。
RP-HPLC使用一种疏水性固定相和一种极性流动相，分析物主要依靠疏水作用来保留。
由于优秀的精确度和可靠性，带有UV检测器的RP-HPLC被用于绝大多数药物纯度评估、质量控制和稳定性测试当中。
其中在稳定性预测分析（Stability-Indicating Analyses）中使用RP-HPLC的另一个原因是出于物料守恒的考虑。
RP-HPLC中化合物的保留和其log P（即水和正辛醇中的分配系数）高度相关，在这种色谱模式中，分析物与固定相较弱的相互作用力确保分析的样品中的所有杂质在方法梯度结束前都从柱子上洗脱下来，从而计入样品中的所有成分（4）。
关于流动相在调控RP-HPLC中的中性和离子化分析物的保留和选择性的作用已经在教科书中被广泛地讨论，详细信息请参考相关文献资料（1-3）。
分析物在RP-HPLC中的保留能力可以通过线性溶剂强度模型（5）来预测，在这个模型中，分析物保留因子的对数与强溶剂的比例成反比。
然而，由于溶质和周围极性溶剂分子的作用而使得这个模型变得非常复杂，因此Horvath等人提出了“疏溶剂作用模型（Solvophobic Interactions Model）”（6），也指出了吸附在疏水固定相表面的单层强溶剂的作用（1）。
同时也存在二级作用，比如碱性基团与固定相表面存在的硅醇基团的相互作用，这个作用也会导致峰拖尾（7）。
在这篇文章，我们将简单阐述RP-HPLC中流动相涉及的基础理论以及流动相选择的最新趋势，如TABLE I所示。
最明显的趋势集中在三个方面：小分子药及生物药的稳定性预测分析、提高UV和MS检测器灵敏度以及碱性分析物峰形的优化。
流动相选择的基础在这部分中，我们会讲述在RP-HPLC中常见的弱流动相（水相）和强流动相（有机相）以及流动相的添加剂的选择标准。
HPLC方法开发如何选择流动相的pH
HPLC方法开发如何选择流动相的pH 2014-02-16 蒋竞波谱分析
HPLC方法开发如何选择流动相的pH
1) 流动相的pH到底由什么决定？
理论上说流动相的pH决定于化合物的pKa 和pKb,
流动相的pH对于酸性化合物至少要远离其pKa 2个单位，也就是说pH-pKa的绝对值需要大于2，对于碱性化合物流动相的pH应该至少远离其pKb 2个单位，就是说pH-pKb的绝对值大于2，
2）为什么是2呢？
pKa=pH-"lg"([A^(-)])/([HA]) 即
pKa=-log ka=-log 氢例子浓度*酸根浓度/分子态酸的浓度=pH-log酸根浓度/分子态酸的浓度
当pka与pH相差两个单位的时候，酸根离子的浓度就与分子态酸的浓度就会相差一百倍，
即pH在pKa,以下两个单位的时候，这个酸性化合物在这个流动相体系中分子态比例为100/101,离子态的比例为1/101，所以最安全的pH最好是离pKa距离 3个单位，这个时候，化合物只有0.1%左右处于离子态。
3）为什么酸性化合物最好选择pKa一下，而碱性化合物却学则pKb以上呢？
从上面分析可以知道，如果酸性化合物选择pKa以上两个单位，这个化合物主要以酸根的形式存在，而我们常用的HPLC体系是反相体系，出峰会比较早，另外带电荷的离子在柱子上也更加容易与填料作用而产生拖尾和峰型不好的问题
4）常见流动相的pH
蒋竞 12-Feb2014。
hplc分析方法开发中流动相的调整
方法1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)
进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整
有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
方法2三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留
因子约增加3倍，此为三倍规则。
这是一个聪明而又省力的办法。
调
整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
方法3粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改
变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情
况不再改变。
先100%的有机溶剂，在降下来。
因为有些分离96%即可分离
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HPLC上岗培训考试试题
HPLC上岗培训考试试题HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析技术，广泛应用于制药、化工、环境监测等领域。
为了提高分析人员的技能水平，许多实验室都会组织HPLC上岗培训考试，以确保操作人员掌握相关知识和技能。
本文将针对HPLC上岗培训考试试题展开讨论。
一、基础知识篇1. HPLC的英文全称是什么？HPLC的英文全称是High Performance Liquid Chromatography，即高效液相色谱。
2. HPLC的工作原理是什么？HPLC利用固定相和流动相之间的相互作用，通过样品在固定相上的分配和再分配，实现对样品成分的分离和定量分析。
3. HPLC中常用的固定相有哪些？常用的固定相有反相、离子交换、凝胶、亲水性等。
4. HPLC中常用的流动相有哪些？常用的流动相有水、有机溶剂、缓冲液等。
5. HPLC中常用的检测器有哪些？常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器、电导检测器等。
二、方法开发与优化篇1. 在HPLC方法开发中，如何选择合适的固定相？选择固定相时需要考虑样品的性质、分离目标和分析条件等因素。
一般来说，反相固定相适用于非极性或弱极性化合物的分离，离子交换固定相适用于离子化合物的分离。
2. 在HPLC方法开发中，如何选择合适的流动相？选择流动相时需要考虑样品的性质、分离目标和分析条件等因素。
一般来说，水和有机溶剂的组合常用于非极性或弱极性化合物的分离，而缓冲液常用于离子化合物的分离。
3. 在HPLC方法开发中，如何选择合适的检测器？选择检测器时需要考虑样品的性质、分离目标和分析条件等因素。
紫外检测器适用于吸收性化合物的检测，荧光检测器适用于荧光性化合物的检测，电导检测器适用于离子化合物的检测。
4. 在HPLC方法开发中，如何优化分离条件？优化分离条件可以通过调整流速、温度、pH值、固定相类型等参数来实现。
一般来说，较高的流速可以缩短分析时间，适当的温度可以提高分离效果，合适的pH值可以影响离子化合物的分离。
sec液相方法开发
sec液相方法开发
高效液相色谱（HPLC）方法开发是一个复杂但至关重要的过程，它涉及到多个步骤，包括选择合适的色谱柱、流动相、检测波长以及优化分离条件等。
下面将详细介绍sec液相方法开发的过程。
首先，选择合适的色谱柱是sec液相方法开发的关键步骤。
色谱柱的类型和规格将直接影响样品的分离效果。
通常，我们会根据样品的性质（如分子量、极性、稳定性等）以及分析需求来选择合适的色谱柱。
例如，对于大分子量的样品，我们可能会选择具有较大孔径的色谱柱以减少样品的吸附和扩散。
其次，流动相的选择也是非常重要的。
流动相不仅决定了样品在色谱柱上的分离效果，还影响到色谱柱的寿命和仪器的稳定性。
在选择流动相时，我们需要考虑其极性、pH值、离子强度等因素。
通常，我们会根据样品的性质和分析需求来选择适当的流动相，并在实验过程中进行优化以达到最佳的分离效果。
此外，检测波长的选择也是sec液相方法开发的一个重要环节。
合适的检测波长可以提高分析的灵敏度和准确性。
一般来说，我们会选择样品的最大吸收波长作为检测波长，以获得最佳的信号响应。
在sec液相方法开发过程中，我们还需要对分离条件进行优化。
这包括调整流动相的流速、梯度洗脱程序等参数，以获得最佳的分离效果和分辨率。
同时，我们还需要注意控制实验条件的一致性，以确保分析结果的准确性和可靠性。
总之，sec液相方法开发是一个复杂而关键的过程。
通过选择合适的色谱柱、流动相和检测波长，并优化分离条件，我们可以获得准确、可靠的分析结果，为科研和工业生产提供有力的支持。
液相流动相缓冲盐选择
下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。
对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。
考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。
当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。
对流动相的优化主要体现在水相上。
流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。
如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。
如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。
（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。
了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。
缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。
例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。
hplc方法学开发和验证 -回复
hplc方法学开发和验证-回复HPLC方法学开发和验证是化学分析领域中常用的技术之一。
HPLC（高效液相色谱）是一种基于液相色谱原理的分析方法，其通过流动相的流动速度和静相的特性分离和测定复杂混合物中的化合物。
在本文中，我们将一步步回答关于HPLC方法学开发和验证的问题。
第一步：方法开发在HPLC方法开发的初期，首先需要明确分析目标和要求。
我们需要确定所要分析的样品类型、目标化合物的特征，并制定分析目标和要求。
例如，我们可能需要确定目标化合物的浓度范围、分离度要求、分离时间和检测灵敏度等。
第二步：样品预处理在样品进入HPLC仪器之前，通常需要进行某些预处理步骤。
这些步骤可以包括样品提取、样品净化、样品稀释等。
这些预处理步骤可以帮助去除干扰物、提高分离效果和检测灵敏度。
第三步：柱的选择选择合适的柱是成功分析的重要因素。
柱的选择应该根据目标化合物的特性、分析目标和样品类型来进行。
一般来说，柱的选择应该包括柱材料、柱尺寸、柱填料和柱温等方面。
第四步：流动相的选择流动相的选择是HPLC方法开发中的关键步骤之一。
在选择流动相时，我们需要考虑目标化合物的极性、溶解度、分离度要求和分离时间等方面。
通常，流动相是由溶剂和缓冲剂等组成的混合物。
第五步：分离条件的优化优化分离条件是使分析目标物分离出来的关键。
在此过程中，我们可以调整流速、温度、柱温、流动相浓度梯度等参数，以获得更好的分离效果。
同时，还可以通过试验不同的柱和流动相组合来优化分离条件。
第六步：检测方法的选择和优化在HPLC方法开发中，检测方法的选择和优化也是重要的一步。
常用的检测方法包括紫外光吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
根据目标化合物的特性和分析目标，选择合适的检测方法，并进行方法的优化，以提高检测灵敏度和选择性。
第七步：方法验证在方法开发完成后，需要对方法进行验证。
方法验证的目的是确保方法的可靠性、准确性和精密度。
常用的验证参数包括线性范围、准确度、重复性、选择性和灵敏度等。
HPLC方法开发——流动相的选择
HPLC方法开发——流动相的选择高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于各个领域的分析和质量控制。
在HPLC方法开发中，流动相的选择是非常重要的一步，它直接关系到分析物的分离和检测的灵敏度。
在选择流动相时，需要考虑以下几个因素：1.溶解性：流动相应具有较好的溶解性，以溶解待测样品，保证样品能够均匀地进入和流出色谱柱，并使分离柱表面保持通透性。
2.酸碱性：流动相的pH值对于分离和保护色谱柱都有一定的影响。
如果待测物具有弱酸或弱碱性，应选择酸性或碱性流动相，以提供足够的离子态物质，促进待测物与色谱柱的相互作用。
3.性能物质：流动相中的性能物质可分为有机和无机两类。
有机性能物质通常用作有机试剂，如甲醇、乙酸乙酯等。
无机性能物质通常用作缓冲剂，如磷酸二氢钠、草酸钠等。
4.流动相比例：流动相比例指的是有机相和水相的比例。
比例的选择应该根据待测样品的特性、分析目的以及色谱柱的类型和性能来确定。
一般来说，比例的选择应该尽量保证样品在色谱柱中保持均匀分布。
5.流速：流动相的流速直接影响色谱柱的分离效果和分析时间。
一般来说，流速越快，分离效果可能越差，但分析时间会缩短。
因此，在流速选择时需要在分离效果和分析时间之间做一个权衡，使得两者达到一个较好的平衡。
在选择流动相时，还需要考虑其他可能的影响因素，如温度、压力等。
温度对于很多分析物的分离效果有重要影响，通常来说，提高温度可以加快分离速度，但也可能导致一些物质不稳定。
压力对于色谱柱的分离效果和寿命有一定影响，高压可以提高分离速度，但也可能损坏色谱柱。
综上所述，流动相的选择在HPLC方法开发中是非常重要的一步。
通过合理选择溶剂、酸碱性、性能物质、比例和流速，可以得到一个合适的流动相组合，以获得较好的分离效果和检测灵敏度。
在选择过程中还需要考虑其他可能的影响因素，以确保色谱分析的准确性和可靠性。
液相色谱方法的开发
液相色谱方法的开发
液相色谱（HPLC）方法的开发通常包括以下几个步骤：
1. 选择合适的色谱柱：根据分析样品的性质和目标成分，选择合适的色谱柱，包括填充物和柱尺寸。
填充物的选择通常考虑分离效果、保留度、选择性等因素。
2. 优化流动相组成：根据样品的特性以及目标成分的极性、溶解度等因素，优化流动相组成，包括溶剂选择、添加剂和缓冲剂的使用等。
通过试错法和理论分析方法，确定最佳的流动相组合。
3. 确定色谱条件：包括进样量、流速、检测波长等。
进样量通常根据分析样品的浓度和柱容量进行确定。
流速的选择与分离效果、分析时间和柱压有关。
检测波长通常根据目标成分的最大吸收波长或最大荧光波长进行选择。
4. 方法验证：对开发的HPLC方法进行验证，包括精密度、线性范围、准确度、重复性、选择性等指标的测定。
此外，还需要进行仪器的精度、重复性和稳定性测试。
5. 方法应用：将开发的HPLC方法应用于实际样品的分析，验证其准确性和可靠性。
在开发HPLC方法的过程中，需要充分考虑样品的特性、目标成分的分离和检测要求，并进行系统的实验设计和优化。
不同的样品和分析目标可能需要不同的方法开发策略，因此开发一个适合的HPLC方法需要一定的经验和专业知识。
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4. 脱气
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低， 连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声 波振荡10-15min。
在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜 渗透技术，在线脱气。
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5. 溶剂过滤器的防护
溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从 而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种 方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
的变化很小。 了解化合物的pKa值，可在pKa±2的范围外调节流动相的
pH值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建立 的方法具有耐用性。
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10．流动相的pH值
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11. 缓冲盐
HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐 现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上, 随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封 垫,造成漏液等故障现象。
现压力的变化 。要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输 液泵或色谱柱能承受的最大压力。
每次梯度洗脱之后必须10~30倍柱容积的初始流动相流经 色谱柱，使其恢复到初始状态。
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10．流动相的pH值
反相离子抑制技术： 采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，
通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离， 增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。
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12. 离子对试剂
离子对试剂使用注意的因素有： 1、离子对的浓度，这个一般情况下在满足要求的前提下
越低越好。 2、 离子对溶液的pH，这个是进行分离的最关键的因素，
而只能在缓冲液中测定pH, 不要混合有机相后测定。 3、如果使用离子对试剂，一定注意平衡时间，正常的话
在60-90分钟才能达到彻底的平衡，还有在实验结束以后 要冲洗超过2个小时，否则柱子可能会不可逆的损伤。 4、用离子对进行实验所用的柱子尽量和其他的非离子对 的分开使用。
Polarity
0.06 1.60 2.40 3.00 3.40 4.00 4.20 4.30 4.40 5.40 6.20 6.40 6.60 6.90 7.20 10.20
Viscosity(cp20℃)
0.33 0.97 0.59 0.65 0.44 2.27 0.55 1.20 0.57 0.32 0.37 0.92 0.60 19.90 2.24 1.00
Boiling Point(℃)
69 77 111 80 40 98 66 79 61 57 82 153 65 197 189 100
UV CutOff(nm)
210 265 285 210 245 210 220 210 245 330 190 270 205 210 260 210
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3. 过滤
分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用 10mmol/L三乙胺溶液， 0.05~0.5%NH4OH。
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10．流动相的pH值
当溶液pH值等于化合物的pKa时，化合物半解离。 在pKa±1.5的范围内，保留随pH值的变化而发生明显变化。 超过此pH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随pH值
9. 梯度洗脱
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的 组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于 分析组分数目多样品。
优点：
缩短分析时间 提高分离度 改善峰形 提高检测灵敏度
缺点：
增加基线漂移 较长平衡时间
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9. 梯度洗脱
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断 变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱 的流动相。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出
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13. 各种检测器对流动相的特殊要 求
13.1 UV：
截止波长:将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐 降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长。
中国药典对UV法溶剂的要求是： 以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度：
在220~240nm范围内不得超过0.40 在241~250nm范围内不得过0.20 在251~300nm范围内不得过0.10 在300nm以上不得过0.05
在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。
等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒 定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别 的样品，多用于含量测定。
优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相 纯度要求低。
缺点：较早洗脱出的品文档
（1）严格执行溶剂过滤 （2）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 （3）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂 瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸 （35%）中浸泡1h，然后用蒸馏水冲洗干净。
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6．流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内，不 要贮存在塑料容器中。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变 化，也防止氧及尘埃溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配 制使用，不要贮存超过规定的有效期。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶 液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的 微生物。
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7．HPLC实验用水
HPLC实验用水除满足药典对纯化水 一般要求外，还需要满足以下要求：
对于ESI（电喷雾电离），需要考虑基质效应： ➢ 对于正离子模式的方法，流动相的pH最好小于5.0，以提
高离子化效率，通常在流动相中添加TFA,FA。 ➢ 对于负离子模式，pH最好大于8.0，通常在流动相中添加
氨水。
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Thank You!
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UV截止波长nm
200(0.1%)
230(10mM) 210(10mM) 210(10mM) 200(10mM) 200(10mM)
12. 离子对试剂
作用原理：离子对试剂与待分析的物质（多为在溶液状态 时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性， 这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。
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13. 各种检测器对流动相的特殊要 求
13.2 ELSD
ELSD对流动相的组成不敏感，可以用于梯 度洗脱；
ELSD要求流动相要蒸发掉，因此不能使用 不易挥发的物质来调节流动相的pH值。
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13. 各种检测器对流动相的特殊要 求
13.3 MSD
由于盐对质谱的损伤很大，故在流动相的选择上，需避 免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐。故一般 离子对色谱和离子抑止色谱方法的流动相是不能直接用 到液质上的。
试剂选择：分析酸性（作用基团）样品一般用阳离子对试 剂（ 四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵），分析碱性样品 用阴离子对试剂（己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠……十二烷基 磺酸钠）
离子对的分离机制------离子对模型 样品离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不
荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。 离子对试剂的烷基C链越长，生成的离子对与固定相的亲 和力越大，因此组分的保留值也越大。 使用离子对试剂浓度尽可能的低（一般0.005mol/L)， 以 保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。
项目
指标
电阻率，MΩ·cm，25℃，最小
18.0
总有机碳（TOC)，mg/L，最大
0.5
微粒，µm滤器
0.22
• HPLC级水增加紫外加吸收要求： 在1cm池中，用HPLC级水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸
收度分别不得过0.01、0.01和0.05。
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8. 等度洗脱
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11. 缓冲盐
缓冲剂
磷酸盐
柠檬酸盐 甲酸盐 乙酸盐 氨水 三乙胺
pKa
2.1 7.2 12.3 3.1 4.7 5.4 3.8 4.8 9.2 11
缓冲范围
1.1-3.1 6.2-8.2 11.3-13.3
2.1-6.4
2.8-4.8 3.8-5.8 8.2-10.2 10.0-12.0
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溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器 起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小， 溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容 易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的 堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞 杆和活塞的磨损。
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HPLC方法开发
——流动
相的选择
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1. 流动相的一般要求
流动相对样品具有一定的溶解能力 流动相具有一定惰性 流动相应不改变填料的任何性质 纯度高 流动相的黏度要尽量小 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 流动相沸点不要太低 应选用挥发性溶剂 流动相配置好后要进行过滤 流动相配制好后要进行脱气
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的解离平衡常数Ka值 越小，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子 形式存在；
对弱碱，流动相的pH值越大，组分的Ka值越大，当pH值远 远大于弱碱的pKa值时，弱碱主要以分子形式存在；
分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用 10～50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.05%TFA ；
在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长
和减小水的表面张力。 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶
液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点， 重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于 混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不 含盐流动相；