HPLC流动相选择
简述高效液相色谱法中流动相的要求
简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分离、定量和分析化合物的分析技术。
其中流动相是HPLC中至关重要的组成部分，它对于保证分离效果和分析准确性起着重要的作用。
在使用HPLC进行分析时，流动相的要求有以下几个方面：1.纯度高：流动相的纯度是保证实验准确性的重要因素。
纯度高的流动相可以减少背景噪音和干扰，提高信号峰的清晰度和分辨率。
纯度要求也有助于减少一些物质的附着和积聚，保护HPLC设备的寿命。
2.溶解性好：流动相要有足够的溶解性，以溶解待分离样品中的化合物。
能够完全溶解的样品可以均匀地分布在流动相中，利于成分的迁移和分离。
如果溶解性不好，可能会导致分离效果不佳、峰形不对称和信号峰低。
3.无气泡：气泡在流动相中会造成流动相的剧烈波动，影响分离效果和信号峰的清晰度。
在流动相中可以通过采取适当措施来去除气泡，包括使用真空除泡器、在流动相中添加脱气剂或在流动相上施加超声波。
4.恒定性好：在HPLC分析过程中，流动相的流动速率和成分应该是恒定不变的，以确保分离的稳定性和重复性。
流速的变化可能会导致信号峰的宽度不一致和峰形变形，从而降低分离效果。
5.选择性好：流动相的选择性是指其与待分离样品之间的相互作用程度。
流动相选择性的好坏会直接影响分离效果和峰形。
根据样品的性质和需求，可以选择不同的流动相，如有机溶剂、水或缓冲盐溶液等。
6.可适应性广：流动相可以根据待分离样品的性质和需求进行选择和调整。
不同的样品可能需要不同的流动相组合和浓度梯度，以达到最佳的分离效果。
综上所述，高效液相色谱法中流动相的要求包括：纯度高、溶解性好、无气泡、恒定性好、选择性好和可适应性广。
这些要求的满足将有助于提高分析结果的准确性和可靠性，同时也可以保护HPLC设备的寿命。
简述高效液相色谱法中流动相的要求
简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种用于分离和分析化学、生物和制药样品的色谱技术。
在高效液相色谱过程中，流动相的选择和性能对分析的准确性和分离效果有着重要的影响。
下面将详细介绍高效液相色谱法中流动相的要求。
1.基础流动相特性：流动相应具有一定的极性和溶解性能。
常用的流动相包括水和有机溶剂，如甲醇、乙醇和乙腈等。
流动相的选择应考虑到待分离组分的性质和分析目的，要保证样品能够溶解并很好的分离。
常用的流动相配比为水/有机溶剂（如乙腈）的比例，比如常见的70:30、50:50等。
2.pH值调节：根据待分离物和色谱柱的性质，适当调节流动相的pH值可以改变待分离物的电离状态，从而影响它们在色谱柱上的分配行为。
比如，对于具有酸性基团的分析物，可以通过酸或碱的加入来调节流动相的pH值，以影响它们与色谱固定相之间的相互作用。
3.离子强度调节：有些样品中可能存在电解质，其离子强度会对分离产生影响。
在这种情况下，可以通过添加相应的盐来调节流动相的离子强度，以改变分析物与色谱固定相的相互作用。
常用的盐有甲酸铵、硫酸铵、三氟乙酸等。
4.流速控制：流动相的流速也对色谱分离的效果有着重要的影响。
流速过快可能导致分离不充分，流速过慢则会增加分析时间。
流速的选择需根据待分离物的性质、色谱柱的尺寸和色谱仪的性能等因素综合考虑。
5.除气和过滤：流动相中的气泡和杂质会影响液相的流动性和检测信号的稳定性。
因此，在使用前应对流动相进行除气处理，以减小气泡对色谱分离的干扰。
同时，对流动相进行过滤处理，可以去除其中的固体颗粒和微生物等。
通常使用0.45μm的滤膜进行过滤。
6.流动相稳定性：流动相应具有良好的稳定性，以保证分析结果的准确性和重复性。
一般来说，流动相中的溶液成分要充分溶解，不发生相分离和析出现象。
所以，流动相的配制要求严格，要遵循相应的配方和混合方法，并在使用前进行充分的搅拌和均匀。
HPLC中固定相和流动相
HPLC中固定相和流动相在色谱分析中,如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离,是色谱工作者的重要工作,也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质(担体)HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质,也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝,无机物基质刚性大,在溶剂中不容易膨胀;有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯,有机聚合物基质刚性小、易压缩,溶剂或溶质容易渗入有机基质中,导致填料颗粒膨胀,结果减少传质,最终使柱效降低。
1、基质的种类:1)硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外,还提供一个表面,可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基,制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常,硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有:①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布,与比表面积成反比。
③比表面积:在液固吸附色谱法中,硅胶的比表面积越大,溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度(率):在反相色谱法中,含碳量越大,溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性:在液固吸附色谱法中,硅胶的含水量越小,其表面硅醇基的活性越强,对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾:在反相色谱法中,主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状:硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶,前者价格较便宜,缺点是涡流扩散项及柱渗透性差,后者无此缺点。
⑧硅胶纯度:对称柱填料使用高纯度硅胶,柱效高,寿命长,碱性成份不拖尾。
2)氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质,也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的,不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是,氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相,并显示出优秀的pH稳定性。
高效液相色谱流动相
高效液相色谱流动相高效液相色谱的流动相(Mobile Phase)液相色谱流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。
与气相色谱相比较，液相色谱流动相不仅可选择范围比较大，而且它是影响分离的一个非常重要的可调节因素。
在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。
一、流动相溶剂的选择高效液相色谱中所选用的流动相溶剂必须能保证该色谱系统的分离过程可重复进行:溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求;溶剂应当不干扰检测器的工作;在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。
从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。
对液相色谱溶剂的要求: 1)溶剂要有一定的化学稳定性, 不与固定相和样品组分起反应。
2)溶剂应与检测器匹配，不影响检测器正常工作。
3)溶剂对样品要有足够的溶解能力，以提高检测灵敏度。
4) 溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。
5) 溶剂的沸点低，有利于制备色谱的样品回收。
液相色谱流动相溶剂的选择步骤选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等选择合适洗脱强度的溶剂:简单样品，2 ? k'? 5;复杂样品，0.5 ? k'? 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值二、表征溶剂特性的重要参数 1)溶剂沸点、分子量、相对密度、介电常数、偶极距、折射指数、紫外吸收截止波长、与液相色谱分离密切相关的最重要的溶剂特性参数是溶剂强度参数?? ，溶解度参数?? ，极性参数P'和粘度η。
2) 溶剂洗脱强度溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力。
在吸附色谱中, "溶剂洗脱强度"与溶剂极性成正比;而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。
在液相色谱常用混合溶剂作流动相。
混合溶剂的P'具有加和性: P'ab= ??aP'a，?? bP'b , ??为某一溶剂的体积分数。
关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢
关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于生命科学、化学、医药、环境等多个领域。
其中，流动相的选择对于色谱分离性能和分析结果的准确性有着重要的影响。
一、流动相的组成流动相是指用于在高效液相色谱仪中运载样品溶液，推动样品通过固定相柱的溶剂体系。
一般情况下，流动相由溶剂和缓冲剂组成。
溶剂用于将样品带入色谱柱，而缓冲剂则用于调整流动相的pH值。
在选择流动相的溶剂时，主要要考虑以下因素：1.溶剂极性：色谱柱的固定相特性和待分析的样品特性决定了所需的溶剂极性。
一般来说，溶剂可以选择非极性溶剂、极性溶剂或者两者的混合物，以适应不同的分析要求。
2.溶剂选择：常用的溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等有机溶剂，以及水。
甲醇和乙腈是最常用的有机溶剂，由于它们的极性较低，因此溶解性广泛。
水是最常用的极性溶剂，可以提供更好的分离效果。
3.透过性：一些样品需要在其中一种溶剂中分离，因此选择适当的溶剂对于分析结果的准确性至关重要。
在选择缓冲剂时，需要考虑以下因素：1.pH值的调整：一些分析需要在特定的pH值下进行，需选择合适的缓冲剂，以维持所需的pH值。
2.缓冲能力：缓冲剂应具有良好的缓冲能力，以维持流动相的pH值的稳定性，避免pH值对分离效果的干扰。
3.溶解度：缓冲剂应具有较高的溶解度，以便在高浓度下使用，从而提供稳定的pH值。
二、常用的流动相系统1.等相流动相系统（Isocratic elution）：等相流动相系统是指流动相组成在整个分析过程中保持不变。
这种系统适用于分离度较差的样品，具有简单、稳定、易操作的特点。
2. 梯度流动相系统（Gradient elution）：梯度流动相系统是指在分析过程中，通过改变流动相组成来实现样品的分离。
这种系统适用于需要分离程度较高的样品，提供了更好的分离效果。
HPLC流动相溶剂的选择和缓冲液的配置
HPLC流动相溶剂的选择和缓冲液的配置请参阅张玉奎翻译L.R.森德尔[LloydR.Snyder]的《实用高效液相色谱法的建立》等专著。
一、HPLC流动相溶剂选择的一般原则：1. 溶剂要与使用的检测器匹配对UV－Vis，主要考虑本底吸收，下面是常用溶剂在不同波长下的吸收值：波长200 205 210 215 220 230 240 250乙腈0.05 0.03 0.02 0.01 0.01 <0.01甲醇 2.06 1.00 0.53 0.37 0.24 0.11 0.05 0.02THF 2.44 2.57 2.31 1.80 1.54 0.94 0.42 0.21醋酸1% 2.61 2.63 2.61 2.43 2.17 0.87 0.14 0.01磷酸0.1%<0.01三氟乙酸 1.20 0.78 0.54 0.34 0.20 0.06 <0.01三乙胺1% 2.33 2.42 2.50 2.45 2.37 1.96 0.50 0.12 研究表明，当流动相的A>0.7的时候，基线噪声会显著增加，一般选择的吸收值<0.5。
当A>1.0时，基本就不能用使了。
对于示差折光检测器，主要考虑样品和流动相的折光率，这里不再赘述。
2. 选用的溶剂粘度要低、沸点适中使用低粘度溶剂，可减小溶质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。
从分离制备和色质连用考虑，沸点要适中，低沸点的溶剂有它的优点；但仅仅用于分析，沸点太低，反而由于溶剂的挥发，造成保留时间的变化。
3. 尽量不用高毒性的溶剂不只是环境，单从我们自身的安全考虑，当然用低毒溶剂最好。
4. 溶剂对样品有足够的溶解力样品如果不能溶解在选用的溶剂里，还怎么分析？不屑多解释。
但如果样品在流动相里溶剂仍然不大，可以用样品的最佳溶剂先溶解，再用流动相稀释，就可以了。
知道了上面选择溶剂的一般原则，就不难理解为什么不同乙醇、丙醇做流动相的原因了，因为它们的粘度大。
HPLC中固定相和流动相
HPLC中固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝，无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀；有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯，有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1、基质的种类：1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布，与比表面积成反比。
③比表面积：在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）：在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性：在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾：在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状：硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差，后者无此缺点。
⑧硅胶纯度：对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
流动相的选择
流动相的选择•采用“HPLC” 级溶剂•避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂•对试样有适宜的溶解度•溶剂粘度要小•与检测器相匹配水的等级–纯化水–蒸馏水–去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物溶剂的等级–HPLC级–优级纯–分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质溶剂的过滤滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动脱气的目的防止由气泡的产生引起的故障防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测不稳定程度1）示差折射率检测器*使折射率变化2）UV检测器（200nm以下）*溶解氧气有吸收3）荧光检测器*溶解氧气有消光作用脱气的方法1. 超身波脱气法2. He清除法3. 使用氟树脂膜的减压脱气法梯度洗脱法梯度洗脱装置：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。
梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度梯度洗脱法的注意点●溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差●梯度混合的溶剂互溶性要好●梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）●查看空白实验的数据。
●遵守分析周期。
HPLC对流动相的要求
HPLC对流动相的要求
①必须是HPLC级的，不与固定相发生化学反应。
②对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10范围内（可用范围）或2～5（最佳范围）。
k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀。
③必须与检测器相适应。
如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。
④粘度小。
⑤必须脱气：由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。
因此，流动相在使用前必须经超声脱气30分钟以上。
⑥过滤：由于流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤，偶尔会卡在单向阀门中，从而产生压力波动。
HPLC固定相与流动相
复杂样品中各种组分的方法。
02
它利用不同物质在固定相和流动 相之间的分配平衡进行分离，通 过检测器检测各个组分的性质和 含量。
HPLC的原理
高效液相色谱法基于物质在固定相和 流动相之间的分配平衡进行分离。
不同物质在固定相和流动相之间的分 配系数不同，因此通过色谱柱时，会 按照一定顺序流出，从而实现分离。
流动相以避免干扰。
测需求选择合适的固定相和流动相组合。
05 HPLC固定相与流动相的 优化
优化分离效果
01
02
03
选择合适的固定相
根据待测物质的性质，选 择具有适宜极性、选择性、 稳定性和寿命的固定相， 以提高分离效果。
调整流动相组成
通过调整流动相的组成， 如改变溶剂类型、比例和 pH值，可以改善分离效果。
固定相的选择
根据化合物性质选
择
对于不同极性和性质的化合物， 应选择具有相应极性和功能基团 的固定相。
根据分离要求选择
根据分离要求，如分离度、分析 时间等，选择具有合适粒度和性 能的固定相。
实验验证
在实际应用中，对固定相的选择 应进行实验验证，以确保其性能 和分离效果符合要求。
03 HPLC流动相
控制温度
适当升高温度可以提高流 动相的流速和降低黏度， 有助于提高分离效果。
提高检测灵敏度
选择高灵敏度检测器
根据待测物质的性质，选择高灵敏度的检测器，如紫 外、荧光、电化学检测器等。
优化检测波长
选择合适的检测波长可以降低背景干扰，提高检测灵 敏度。
降低样品浓度
通过优化样品处理和稀释方法，降低样品浓度，可以 降低检测限和提高灵敏度。
流动相的组成和性质也会影响分离效果。例如，使用不同的有机溶剂或 混合溶剂可以改变流动相的极性和粘度，从而影响物质在固定相上的吸 附和解析能力。
hplc法对流动相的要求
hplc法对流动相的要求
高效液相色谱（HPLC）是一种分离和分析化合物的方法，流动相在该方法中起着至关重要的作用。
HPLC法对流动相有以下要求：
1. 溶解性，流动相中的溶剂应该能够有效地溶解待分离的化合物，以便在色谱柱中进行有效的分离。
2. 稳定性，流动相的成分应该是稳定的，不会在分析过程中发生分解或反应，以免影响分析结果。
3. 低粘度，流动相的粘度应该尽可能低，以便在色谱柱中获得良好的分离效果，并且减少对色谱柱的影响。
4. 合适的极性，流动相的极性应该与待分离的化合物相适应，以便实现有效的分离。
5. 无挥发性，流动相中的成分应该是无挥发性的，以免在色谱柱中形成气泡或者影响检测器的准确性。
总的来说，HPLC法对流动相的要求是要求其能够有效地溶解待
分离的化合物，稳定性好，粘度低，极性适当，并且无挥发性。
这些要求可以保证色谱分离的准确性和稳定性，从而得到可靠的分析结果。
HPLC方法开发如何选择流动相的pH
HPLC方法开发如何选择流动相的pH 2014-02-16 蒋竞波谱分析
HPLC方法开发如何选择流动相的pH
1) 流动相的pH到底由什么决定？
理论上说流动相的pH决定于化合物的pKa 和pKb,
流动相的pH对于酸性化合物至少要远离其pKa 2个单位，也就是说pH-pKa的绝对值需要大于2，对于碱性化合物流动相的pH应该至少远离其pKb 2个单位，就是说pH-pKb的绝对值大于2，
2）为什么是2呢？
pKa=pH-"lg"([A^(-)])/([HA]) 即
pKa=-log ka=-log 氢例子浓度*酸根浓度/分子态酸的浓度=pH-log酸根浓度/分子态酸的浓度
当pka与pH相差两个单位的时候，酸根离子的浓度就与分子态酸的浓度就会相差一百倍，
即pH在pKa,以下两个单位的时候，这个酸性化合物在这个流动相体系中分子态比例为100/101,离子态的比例为1/101，所以最安全的pH最好是离pKa距离 3个单位，这个时候，化合物只有0.1%左右处于离子态。
3）为什么酸性化合物最好选择pKa一下，而碱性化合物却学则pKb以上呢？
从上面分析可以知道，如果酸性化合物选择pKa以上两个单位，这个化合物主要以酸根的形式存在，而我们常用的HPLC体系是反相体系，出峰会比较早，另外带电荷的离子在柱子上也更加容易与填料作用而产生拖尾和峰型不好的问题
4）常见流动相的pH
蒋竞 12-Feb2014。
HPLC流动相的选择
变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附
剂的柱系统。
②纯度
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是 当溶剂所含杂质在柱上积累时。 ③必须与检测器匹配。
2. 反相色谱 流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定 量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙 腈、四氢呋喃等。 极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的 保留值和分离选择性有显著影响。 一般情况下，甲醇-水系统是反相色谱最常 用的流动相，具有粘度小、价格低的特点。 Snyder推荐采用乙腈-水系统。溶剂强度较 高且粘度较小，并可满足在紫外205nm处检 测的要求，但价格较贵。
（3）对电化学检测器 在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧 的影响更大。 （4）除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检 测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中 的灵敏度。
3.脱气方法 氦气脱气法
电磁脱气法
超声波脱气法
超声脱气优点：10-20分钟已足够；
不影响溶剂组成。
注意：超声时应避免溶剂瓶与超声槽底部或壁 接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出 水面太多。
六、液相色谱流动相的脱气 1.脱气的必要性 所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统 内逸出气泡，影响泵的工作。 气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的 灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。 溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相 甚至固定相（如烷基胺）反应。 溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离 或分析结果带来误差。
2.溶解氧的危害
（1）对紫外检测器 溶解氧能与甲醇、四氢呋喃等形成有紫外吸收 的络合物。 此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以 下），并导致检测灵敏度的轻微降低；
hplc的流动相
hplc的流动相HPLC的流动相HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分析方法，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
在HPLC分析过程中，流动相是至关重要的组成部分，它直接影响着分析结果的准确性和可靠性。
流动相是指在HPLC柱中流动的溶剂或溶液，它能够将样品带入柱中进行分离。
流动相的选择要根据待分析物的性质和目的来确定，常见的流动相包括有机溶剂和水的混合物，以及酸性或碱性缓冲液等。
有机溶剂是HPLC中常用的流动相之一。
有机溶剂具有良好的溶解性和流动性，能够有效地溶解待分析物，并在柱上产生合适的保留时间。
常见的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈等。
选择有机溶剂时，要考虑其溶解度和挥发性，以及对柱和检测器的影响。
水是另一种常用的流动相。
水是广泛存在于自然界中的溶剂，具有良好的溶解性和流动性。
在HPLC中，水常用作极性物质的流动相，能够有效地分离极性化合物。
此外，水还可以与有机溶剂混合使用，以调节溶剂的极性，实现对不同化合物的分离。
除了有机溶剂和水，酸性或碱性缓冲液也常用作流动相。
酸性或碱性缓冲液可以调节流动相的pH值，对某些具有酸碱性的化合物具有良好的溶解性和分离能力。
常见的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸缓冲液等。
选择缓冲液时，要考虑其缓冲能力、稳定性以及对柱和检测器的影响。
在HPLC分析中，流动相的选择要根据待分析物的性质和目的来确定。
一般来说，对于非极性物质，可以选择有机溶剂作为流动相；对于极性物质，可以选择水或酸碱缓冲液作为流动相。
此外，还需要考虑流动相与柱和检测器的相容性，以及流动相的流速和温度等因素。
HPLC的流动相是HPLC分析中不可或缺的组成部分，它直接影响着分析结果的准确性和可靠性。
在选择流动相时，需要根据待分析物的性质和目的来确定，并考虑流动相与柱和检测器的相容性。
合理选择和优化流动相的使用，可以提高HPLC分析的效果，为科学研究和生产实践提供可靠的数据支持。
高效液相色谱法常用的流动相
高效液相色谱法常用的流动相
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，其流动相的选择对分离效果至关重要。
常用的流动相分为以下几种：
1. 甲醇：甲醇是一种常用的有机溶剂，具有良好的溶解性和极性。
在反相色谱中，甲醇常与水混合作为流动相，以实现对极性物质的分离。
2. 乙腈：乙腈是一种有机溶剂，具有较高的极性。
与甲醇类似，乙腈也可以与水混合作为流动相，用于反相色谱中对极性物质的分离。
3. 水：水是一种无机溶剂，具有良好的极性。
在正相色谱中，水常与有机溶剂（如甲醇、乙腈等）混合作为流动相，以实现对极性物质的分离。
4. 乙酸乙酯：乙酸乙酯是一种有机溶剂，具有较弱的极性。
在正相色谱中，乙酸乙酯可以与水混合作为流动相，用于分离弱极性物质。
5. 庚烷：庚烷是一种非极性有机溶剂，适用于分离非极性物质。
在反相色谱中，庚烷可以与甲醇或乙腈混合作为流动相。
6. 混合溶剂：根据被测物的极性和分离需求，可以选用两种或多种溶剂混合作为流动相。
例如，甲醇与水混合用于反相色谱，乙腈与水混合用于正相色谱等。
流动相的选择应考虑以下因素：
1. 被测物的极性：根据被测物的极性选择相应的流动相，以实现良好的分离效果。
2. 固定相的选择：根据固定相的极性，选择与之匹配的流动相。
3. 检测器的要求：某些检测器对流动相的极性有要求，需根据检测器类型选择合适的流动相。
4. 实验条件：如流速、柱温等实验条件，也会影响流动相的选择。
在高效液相色谱法中，常用的流动相包括甲醇、乙腈、水、乙酸乙酯、庚烷等，具体选择需根据被测物的极性、固定相、检测器要求等因素综合考虑。
hplc的原理和应用范围
HPLC的原理和应用范围前言高效液相色谱（HPLC）是一种重要的色谱技术，广泛应用于化学、生物化学、药学等领域。
本文将介绍HPLC的原理以及其在不同领域的应用范围。
一、HPLC的原理HPLC是一种基于溶液中的样品分离和分析的技术。
其主要原理是通过样品溶解于液相（流动相）并通过固定相（柱填料）的作用下进行分离。
HPLC的主要原理包括以下几个方面： 1. 流动相选择：HPLC中常用的流动相包括有机溶剂、水和缓冲溶液等。
流动相的选择要考虑样品的性质以及所需的分离效果。
2. 柱填料选择：柱填料是HPLC中的固定相，常见的填料包括C18烷基硅胶、聚合物和离子交换树脂等。
柱填料的选择要考虑样品的性质、分离效果和分析速度。
3. 色谱条件优化：包括流速、柱温、检测器选择等参数的优化，可以提高分离和分析效果。
二、HPLC的应用范围HPLC在各个领域中都有广泛的应用，下面将介绍几个主要的应用领域。
1. 化学分析HPLC在化学分析中可以用于分离和测定多种化合物，包括有机化合物、无机化合物和生物大分子等。
例如，HPLC可以用于药物的纯度分析、食品中添加剂的测定、环境样品中有机污染物的分析等。
2. 生物化学HPLC在生物化学研究中起到了重要的作用。
例如，HPLC可以用于蛋白质的分离和纯化，常见的应用包括蛋白质鉴定、肽段分析和蛋白质结构研究等。
此外，HPLC还可以用于核酸的分离和纯化，例如DNA和RNA的测序等。
3. 药学在药学领域，HPLC广泛用于药物的分析、纯化和质量控制等方面。
例如，通过HPLC可以准确测定药物含量、纯度和相关物的含量，从而保证药物的质量和安全性。
4. 环境监测HPLC可以用于环境样品中有机污染物的分析和监测。
例如，通过HPLC可以准确测定水中的有机溶剂、农药和重金属等污染物的含量，从而评估环境的污染程度。
5. 食品安全HPLC在食品安全领域中有着重要的应用。
例如，HPLC可以用于食品中添加剂、农药残留物和有害物质等的检测和分析。
HPLC方法开发——流动相的选择
HPLC方法开发——流动相的选择高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于各个领域的分析和质量控制。
在HPLC方法开发中，流动相的选择是非常重要的一步，它直接关系到分析物的分离和检测的灵敏度。
在选择流动相时，需要考虑以下几个因素：1.溶解性：流动相应具有较好的溶解性，以溶解待测样品，保证样品能够均匀地进入和流出色谱柱，并使分离柱表面保持通透性。
2.酸碱性：流动相的pH值对于分离和保护色谱柱都有一定的影响。
如果待测物具有弱酸或弱碱性，应选择酸性或碱性流动相，以提供足够的离子态物质，促进待测物与色谱柱的相互作用。
3.性能物质：流动相中的性能物质可分为有机和无机两类。
有机性能物质通常用作有机试剂，如甲醇、乙酸乙酯等。
无机性能物质通常用作缓冲剂，如磷酸二氢钠、草酸钠等。
4.流动相比例：流动相比例指的是有机相和水相的比例。
比例的选择应该根据待测样品的特性、分析目的以及色谱柱的类型和性能来确定。
一般来说，比例的选择应该尽量保证样品在色谱柱中保持均匀分布。
5.流速：流动相的流速直接影响色谱柱的分离效果和分析时间。
一般来说，流速越快，分离效果可能越差，但分析时间会缩短。
因此，在流速选择时需要在分离效果和分析时间之间做一个权衡，使得两者达到一个较好的平衡。
在选择流动相时，还需要考虑其他可能的影响因素，如温度、压力等。
温度对于很多分析物的分离效果有重要影响，通常来说，提高温度可以加快分离速度，但也可能导致一些物质不稳定。
压力对于色谱柱的分离效果和寿命有一定影响，高压可以提高分离速度，但也可能损坏色谱柱。
综上所述，流动相的选择在HPLC方法开发中是非常重要的一步。
通过合理选择溶剂、酸碱性、性能物质、比例和流速，可以得到一个合适的流动相组合，以获得较好的分离效果和检测灵敏度。
在选择过程中还需要考虑其他可能的影响因素，以确保色谱分析的准确性和可靠性。
HPLC流动相的选择
题目：HPLC流动相的选择来源：中国化学化工论坛主要内容：主要讲了在进行HPLC时，对流动相的选择及各流动相对样品处理的要求。
液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
一、反相色谱柱的选择1．柱子的pH值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的pH范围。
一般的C18柱pH值范围都在2-8，流动相的pH值小于2时，会导致键合相的水解；当pH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱入口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相pH较高或经常使用缓冲液时，建议选择pH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱pH 2-9或Zorbax的pH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim 极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有好的立体选择性。
二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
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液相色谱的柱子通常正相柱和反相柱。
正相柱以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：
一、反相色谱柱的选择
1．柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim 柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱
戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有好的立体选择性。
（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）
二、液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有样，测得的结果才有可比性。
但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。
如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。
最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45 µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三．色谱柱的维护
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。
新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。
请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。
每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：
a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）
b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。
2．色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。
可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一廉价的泵进行柱子的再生。
建议用来冲洗柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-4mm 1.6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml
选择再生方法：
极性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料）的再生：
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水
注意：
a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
a．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
c．避免流动相组成及极性的剧烈变化
d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中
f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。
在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度婕 缘脑銮慷 跞酢?BR>正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。
极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。
一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。
但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。
反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氢呋喃＝0.66C甲醇
C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。
100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。