改善反向液相色谱峰拖尾的方法

改善反向液相色谱峰拖尾的方法

改善反相HPLC中的峰拖尾一、溶解样品的溶剂极性强于流动相引起的拖尾现象:

1、先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重; 分离碱性化合物、通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾

2、进样量减少或样品经流动相稀释后进样峰拖尾情况减轻。峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。(峰

之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关;准确度和精密度因数据系

二、由样品量(进样量超过柱子容量)过载引起的峰拖尾统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响)

现象: 峰拖尾原因及解决方案

1、样品峰呈现直角三角形，当更多的样品量注入时，峰前端变尖、

编号原因解决方案后端拖尾更严重。

2、色谱柱过载后，保留时间随样品量的增加而提前。(见图3) 样品溶剂在流动相中溶解样品，或者将样品经解决方案:减少进样量一极性强于流流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求，动相总之尽可能降低样品溶剂的强度柱直径(mm)参考最大样品样品量过减少进样量，参考表2中推荐的不同ID 量(mg) 二载柱型对应的不同进样体积 10 35-65 1.调节流动相的pH<3.0。 4.6 4.5-9.0 2.增加流动相的离子强度，25mM,3.0 2.0-4.0 50mM。表2 HPLC色谱柱的直径、参考的最大进样量、进样量的范围硅醇基与

因为实际进样量依赖于柱子的填料(具有高的表面积的填充材料三胺类物质的3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM

可以具有大的进样量)，分析物质(分子量大的进样量要少)，和其他结合的TEA(三乙胺)。

的因素比如样品在流动相中的溶解性。 4.选择低硅醇活性的固定相。参照图6 C18柱按固定相硅醇活性分级。

1.增加流动相中盐的浓度，25mM,

50mM。酸性物质四在硅胶上的2.调节流动相的pH<3.0 吸附 3.增加竞争性

的有机酸，1%醋酸或者是0.1%TFA(三氟乙酸) 更换新的色谱柱五柱子空隙尝

试填充空隙很少能达到较好的效果。

图3 样品量过载引起的拖尾三、固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾

原因:带正电荷的溶液(胺类)与固定相颗粒表面上的酸性硅醇

发生了离子交换，引起二次保留(图 4)，常见于固定相具有显著的硅醇

活性的的色谱柱，中性pH(6,8)条件下比酸性pH(<3)更易发生。

酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应

的影响。

解决:

1、确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件

下操作(使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少溶质与硅醇反应的几

率)。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。

在pH<3的条件下操作，可减少由图4相互作用引起的峰拖尾，

原理:

表3 反相HPLC常用缓冲液

缓冲液范UV截止波长缓冲液 pKa 围 (nm)

2.1 1.1,

3.1

7.2 6.2,8.2 磷酸盐 200 11.3,12.3 13.3

醋酸盐 4.8 3.8,5.8 210 3.1 2.1,4.1

柠檬酸盐 4.7 3.7,5.7 230

5.4 4.4,

6.4

Tris(三羟甲基氨基8.3 7.3,9.3 205 甲烷) 10.0,三乙胺 11.0 200 12.0 缺点:此法增加了分析方法复杂性并且改变色谱柱性质不易逆转。固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交

强度胺类(如三乙胺)，不易从色谱柱上洗脱下来。既用过含有TEA换位点，经反相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引

的色谱柱就不再适合应用于流动相中不含TEA的分析。起峰的保留(二次保留)和峰拖尾。原理:三乙胺与硅醇强烈作用，减少了样品混合物中胺类与硅醇2、在流动相中加入竞争性的胺类，如:在流动相中加入三乙胺的作用，因此，使用三乙

胺可以不用选择低硅醇活性的固定相。 (TEA)(多数情况下，约10mM即可)。TEA 可以与硅醇发生强的反反相HPLC色谱柱检测固定相硅醇活性的方法:根据阿米替林的

应，并抑制样品中的胺类与硅醇反应。对称性(峰拖尾)，柱子对称性低则硅醇活性低。阿米替林在固定相中如图5:向流动相中加入TEA用来提高峰形拖尾较低(对称值低)，则固定相硅醇活性较低，并且检测碱性化合物

时就会有较低的拖尾。图6根据测定阿米替林的对称性(即硅醇活性)

排列了常用的C18反相色谱柱

1.苯丙醇胺

2.麻黄碱

3.苯丙胺

4.甲基苯丙胺

5. 苯三胺色谱

柱:4.6×150mm，5um

流动相:80%甲醇;20%0.05M磷酸盐缓冲液pH7 色谱柱:Eclipse XDB-C8，

4.6*150mm

流速:2.0ml/min 流动相:85%25mMNa2HPO4，pH7.0，15%ACN 温度:24? 流

速:1.0ml/min 样品:阿米替林温度:35?

样品:苯丙胺类

四、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾五、柱床空隙引起的拖尾

原因:硅胶固定相的吸附。随填装技术完善，柱头空隙越发少见，除非在极高的压力或流速

解决:提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应，降低流动相的pH的条件下装柱时可能出现。

使硅醇和溶质质子化，必要时可以向流动相中加入竞争性的酸(如图)。现象:平时色谱柱柱效良好，突然性发现所有的峰均拖尾时;

先洗脱出的峰较后洗脱的峰更易受柱空隙的影响。

解决:更换柱子。

色谱柱:4.6×150mm，C18

流动相:40%5mMNaH2PO460ACN

样品:布洛芬(酸性化合物，严重拖尾，向流动相中加入乙酸可

以改善。乙酸优先和硅胶固定相表面的酸性硅醇基反应，抑制了布洛芬和硅醇基的反应，减低了拖尾。)