β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法ppt课件

PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循 环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增 ： 反应液管（做好记号） 5000rpm，2秒 加入 2ul DNA溶液
总体积25微升
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
PCR扩增条件
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
3.杂交 ：
结果判断
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技 术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一 次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代 固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式， 具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、 基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β地中海贫血是指β链的合成受部分或完全 抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故 常用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。我国 各民族的β地贫基因突变情况有一定差异，南方 汉族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、 IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占 85%～90% 。
【原理】
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼 龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快 速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检 测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值
【操作步骤】
【原理】
PCR技术原理
⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、 引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过 一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。 在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核 苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿 模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这 种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
42洗涤15min
显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。