标准操作规程(SOP)——流感病毒的鸡胚分离方法

一、目的

流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。本SOP 是为确保鸡胚分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。

二、范围

适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感病毒的鸡胚分离。

三、程序

（一）生物安全要求

H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。 其余流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。其余流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。

（二）材料

1．9～11日龄SPF 鸡胚

2．照卵灯

3．70%～75％酒精

4．一次性注射器

5．鸡蛋开孔器

6．蜡或医用胶布

7．液体石蜡

8．15mL 无菌离心管、试管架

标准操作规程（SOP ）——分离方法

9．10mL无菌移液管

10．无菌镊子。

（三）实验步骤

1．验卵

（1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。

（2）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。

（3）如何判断鸡胚状态

1）血管：活胚血管清晰，死胚模糊，成淤血带或淤血块

2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。

3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。

2．鸡胚接种

（1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。

（2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10×6mm裂口。

（3）用注射器吸200µL处理过的临床标本，装上16号针头。

（4）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位

置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进

入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100µL临床标

本。将针头退出至1/2寸，将另外100 µL临床标本注入鸡胚尿囊腔。

（5）用同一注射器将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。

（6）用注射器反复吸取2‰次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器桶中。

（7）用蜡或者消毒过的医用胶布封口。

（8）35℃或37℃温箱（哺乳动物流感病毒35℃培养）培养鸡胚2～3天。

鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。