各种培养基的配置及注意事1

各种培养基的配置及注意事项

6-BA配置：

配置时要加入少量稀酸或97%酒精，再加入蒸馏水，可适当加热。

IBA配置：

配置时要加入少量稀碱，再加入蒸馏水。

注意：

配这两种溶液时，若直接加蒸馏水，则不溶。（注：溶解生长素时，可用少量0.5~1N 的NaOH或95%酒精溶解；溶解分裂素类用0.5~1N的HCl加热溶解，如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时再加热水。）

MS固体培养基：

以配1LMS固体培养基为准：

MS固体干粉41.5g

蒸馏水1L

2g/l的6-BA 2.5ml

2g/l的IBA 0.25ml

注意：待溶液配好后，用pH计将溶液的pH值调到5.8~ 6.0，煮沸至均匀无沉淀后，分装20小瓶（即50mL/瓶），灭菌之前盖子不要拧太紧，出锅后再拧紧盖子。

MS液体培养基：

以配1LMS液体培养基为准：

母液1①5ml

母液1② 10ml

母液1③ 5ml

母液2 1ml

母液3 5ml

母液4 1ml

2g/l的6-BA 0.5ml

2g/l的IBA 0.1ml

蔗糖30g

注意：待溶液在烧杯中混匀之后，转移到1000ml的容量瓶中定容。

LB液体培养基：

以配1LLB液体培养基为准：

蛋白胨（TRYPTONE）10g

酵母提取液（YEASTExTrACT）5g

NaCl 10g

注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到1000ml的容量瓶中定容。待灭菌结束后，温度降至55℃左右（不烫手）时，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。

LB固体培养基：

以配1LLB固体培养基为准：

蛋白胨（TRYPTONE）10g

酵母提取液（YEASTExTrACT）5g

NaCl 10g

琼脂粉15g

注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到1000ml的容量瓶中定容。待灭菌结束后，温度降至55℃左右（不烫手）时，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。在进行到平板。

组织培养体系的建立

外植体获得

具体操作：

1．将外植体（用镊子）夹到其中一个空培养罐中

2．倒入75%的酒精消毒30S，重复三次。

3．倒入升汞消毒4min，一次。

4．倒入蒸馏水清洗，重复三次。

5．盖上盖子，备用。

6．点燃酒精灯，在另一只空的培养罐中倒入些75%的酒精（用于铁制仪器消毒）。7．将铁架子在酒精灯上进行消毒，镊子和手术刀浸入培养罐中，然后放在酒精灯上灼烧，起杀菌作用。

8．用镊子夹住一培养皿在酒精灯上稍微烫下，灭菌。

9．在培养皿中倒入少量的蒸馏水。

10．用经冷却的镊子将外植体夹到带少量蒸馏水的培养皿中，用刀切取其腋芽，将腋芽外的壳小心剥去，再在腋芽的尖端切一刀，使其暴露生长点。

11．打开培养基瓶子之前在酒精灯上稍微烫下，打开瓶盖后，瓶口在酒精灯上灼烧下，以防污染。

12．用镊子将腋芽植入培养基中，瓶口灼烧下，旋紧盖子。

注意：镊子和手术刀要经常灼烧，必要时可将镊子和刀柄进行高压灭菌，以防污染。

1)组织培养诱导芽再生

具体操作：

1.点燃酒精灯，从装有酒精的培养罐中拿出刀和镊子在酒精灯上灼烧。

2.用镊子夹住一培养皿在酒精灯上稍微烫下，灭菌。

3.待刀和镊子冷却后，从一培养瓶中取出芽丛放在准备好的培养皿上。

4.用刀切取其嫩芽，并把老芽切短。

5.将嫩芽植入培养基中，通常是每瓶培养瓶中接6颗老芽或7颗嫩芽。

注意点同上。

2)组织培养诱导根再生

具体操作和注意点同上，不同是此过程只需要用到健壮的幼芽。

3)植物移栽、驯化

具体操作：

1.从瓶中取出竹苗，洗净培养基，

2.寄栽于育苗箱的基质上(珍珠岩∶砂壤土=1∶1)，浇足定根水，定期喷洒营养

液（MS培养液），

3.用塑料膜调节温度、湿度和光照，

4.统计成活率及竹苗生长状况，待新发健壮根系后移往大棚。

转基因体系的建立

农杆菌培养

具体操作：

1.挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落。

2.接种在50mg/LKana 的LB 液体培养基中，28℃，160rpm 振荡培养过

夜。

3.活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的LB液体培养基中。

4.继续培养至对数生长期至OD=0.3～0.6，测量时使用波长为600nm，准备

感染用。

农杆菌浸染预培养材料

具体操作：

1.5000rpm离心20min，收集菌体。

2.用1/2MS液体培养基（含有50mg/L乙酰丁香酮）悬浮准备感染用。

3.将事先培养好的芦竹嫩芽浸入含有农杆菌菌液的液体MS液体培养基中。

4.感染20min～30min，取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的菌液。

共培养

具体操作：

将浸染过的芦竹嫩芽接种在含有50mg/L乙酰丁香酮（AS）的固体MS培养基上，进行共培养。

去除农杆菌

具体操作：

5.若干天后，将芦竹从培养基中取出放入无菌水中冲洗，直至无菌水澄清。

6.再将芦竹加到500mg/L羧苄青霉素（Carb）的液体MS培养基，洗5-10min。

7.取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的液体。

8.将芦竹接到500mg/L羧苄青霉素(Carb)和10mg/L潮霉素（Hygr）固体

MS培养基上。

培养

具体操作：

1.数天后，将芦竹从500mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素固体MS培养

中取出。

2.将其转接到只含有激素的固体MS培养基中中去。

选择

具体操作：

通过观察，选择出抗性芽。

根诱导及植株再生

9.待培养筛选的抗性芽长至1～1.5cm 时。

10.切下并转入含有500mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素的生根培养基上诱

导生根。

11.获得具有潮霉素素抗性的转基因植株。

鉴定PCR, Southern blot 分析

基本按照Sam brook 等的方法。植物DNA 经Eco R I 或H ind B am H I 酶切后, 在018% 琼脂糖凝胶上电泳过夜.电泳缓冲液为1×TA E。DNA 片段分离开后通过毛细作用转移缓冲液为10×SSC。Southern N分子杂交所用探针为H ind B am H I 酶切pROA 93 产生的1 kb 片段, 此片段为N PT基因的一段编码顺序。

生物鉴定

将芦竹放入含有磷的水中通过鉴定水中磷含量的变化来测定芦竹的聚磷效果。