培养基配制和灭菌方法验证
无菌检查用培养基灭菌后的保存有效期的验证方法
无菌检查用培养基灭菌后的保存时限验证方法
1项目描述
质量控制部无菌检查用培养基为硫乙醇酸盐流体培养基及胰酪大豆陈液体培养基，此两种培养基均为商品化的脱水培养基。根据《中国药典》2023版规定，无菌检查用的硫乙醉酸盐流体培养基和胰酪大豆豚液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求，制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存，并在经验证的保存期内使用。因此，拟对胰酪大豆月东液体培养基及硫乙醛酸盐流体培养基在灭菌后的保存期进行验证，验证方法为：培养基灭菌后冷处保存（冰柜保存
2~10°C）,确认在保存期内两种培养基的PH值、无菌性及灵敏度是否符合要求；每种培养基应进行三个配制批次验证；分别确认培养基在灭菌后保存0天、1天、2天、3天、4天、5天的PH值、无菌性检查及灵敏度检查是否符合要求；根据验证结果，确认硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆腺液体培养基在灭菌后的保存时限。
2.目的
对无菌检查用培养基灭菌后的保存时限进行验证，确认无菌检查用培养基灭菌后在保存有效期内的PH值、无菌性检查及灵敏度检查是否符合要求。
3.范围
本验证文件的范围仅适用于质量控制部无菌检查用培养基制备好后的保存时限的验证，验证项目包括：先决条件确认、实验设备及器材确认、培养基确认、灭菌效果确认、包装储藏确认、培养基PH值确认、培养基无菌性检查确认及培养基灵敏度检查确认。
4.职责
4.1质量控制部职责：
负责验证方案、报告的起草；
负责按照批准的方案进行验证操作；
负责对验证数据进行收集、整理、分析；
药典无菌检查方法验证及操作要点
另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同 上，作为对照.
将含培养基的容器按规定温度培养3～5天 。
各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。
加
供
试
金 葡
铜 绿
白 念
品
枯
生
黑
草
孢
曲
霉
对
照
金
铜
白
宁愿辛苦一阵子，不要辛苦一辈子
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4、
。08:2 8:3208: 28:320 8:28Thursday, November 05, 2020
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积极向上的心态，是成功者的最基本要素 5、
。20.1 1.520.1 1.508:2 8:3208: 28:32N ovembe r 5, 2020
生活总会给你谢另一个谢机会，大这个机家会叫明天 6、
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改 良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查 及灵敏度检查的要求。
2.4.1无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14 天，应无菌生长。
菌种
菌株传代次数 培养基接种
结果判断
2.4.2 灵敏度检查
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉
药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证
从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作
外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
培养基配制、适用性检查标准操作程序
目的：制定培养基配制、培养基适用性检查的标准操作程序。
范围：适用于微生物实验室培养基的配制和适用性检查。
责任者：微生物检验员
所用器具、仪器、材料、菌种
器具、仪器：高压蒸汽灭菌锅、高温灭菌柜、隔水恒温培养箱、生化培养箱、双人净化操作台、单人净化操作台、干燥箱、恒温水浴锅、电子天平、500ml三角瓶、移液管、培养皿、试管、接种环、酒精灯
材料：标准干燥培养基（购于生物研究所）、待验证培养基
菌种：大肠杆菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、
枯草芽孢杆菌CMCC （B）63501、白色念球菌CMCC （F）10231
沙门氏菌CMCC （B）50094
1. 培养基的配制
1.1 准备工作
1.1.1 选择适宜容量的容器配制试剂，配制培养基的容器应为玻璃容器，以避免接触金属离子，如吸管、试管、三角瓶和平皿等，应按《玻璃容器清洗规程》洗涤、干燥、灭菌。
1.1.2 配制用水
培养基配制用水应为纯化水，纯化水应临用新配。
1.2 配制
1.2.1 记录所用脱水培养基的品名、批号、生产日期、生产厂家及配制处方。
1.2.2 用分度值为0.01的电子天平准确按处方量进行称量并装入三角瓶内。
1.2.3 用量筒按照培养基处方配比加入纯化水。
1.2.4 用硅胶橡皮塞塞上瓶口，轻轻振摇使充分混匀。
1.2.5 培养基在配置后必须进行PH值的测定，以确保符合药典要求和生产厂家的规定，一般情况下，PH值不能超过规制值±0.2。
1.2.6 用牛皮纸包扎瓶口，贴上标签，注明品名、批号、配置日期、配置人、有效期。
培养基验证
1. 稀释液的制作
磷酸盐缓冲稀释液
贮存液：
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g
蒸馏水500mL
用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2（图1-1、1-2），用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：用蒸馏水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于合适容器,121℃高压灭菌15min。
1-1 1-2
2. 培养基制作
①计算出所需数量，用电子称、称量纸、药勺来称取。
②放入比所用蒸馏水大的烧瓶中，使之充分混匀于蒸馏水后加热溶解并煮沸。
※备注：即使是同一培养基，各个厂家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分参照培养基上的说明。
2.1 倾注培养培养基：
）
●平板计数琼脂等：高压灭菌后保存，使用时加温溶解。
●去氧胆酸盐琼脂培养基：使用时将培养基粉末加温溶解。
※备注：倾注培养时，向培养基分注的步骤参照下述的注意事项
①样液稀释以及从接种到培养基混合完毕，最好在15分钟以内完成。
②每个平皿的分注量约15-20ml。分注后将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要
让培养基从平皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。
③分注时三角烧瓶挂有培养基滴时，下一次分注的培养基可能被烧瓶外壁的细菌污染，所
以要用酒精棉擦拭，再将瓶口用火焰灭菌。
2.2 平板培养基：
平板培养基是将溶解后的培养基分注15-20ml到无菌平皿里，使之凝固。
●TCBS琼脂培养基、DHL琼脂培养基：加温溶解后，分注、凝固、干燥表面。为了防止
沉淀的发生，加温溶解后要充分混匀（注意不要起泡）。
●EMB琼脂培养基：高压灭菌后，分注、凝固、干燥表面。
7.铜绿假单胞菌检查用培养基适用性检查验证方案
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
2.验证目的：本次验证的目的是确认铜绿假单胞菌检查用培养基适用性检查用的溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。
3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：微生物控制菌检查”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。
4.验证项目：溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的适用性检查。
5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。
7.验证小组人员及职责：
7.1验证小组人员:
7.2验证人员职责及要求
7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。
7.2.2认真观察并做好验证原始记录。
7.2.3对实施验证的结果负责。
7.3验证中各部门的职责
7.3.1验证领导组职责
7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。
7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。
7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。
7.3.1.5负责验证报告的批准工作。
7.3.2验证项目小组职责
培养基配制和灭菌方法验证
三、年月日—年月日，验证工作实施。
四、年月日—年月日，根据验证情况与记录，书写验证报告。
五、
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌法
验证小组
组 长：
成 员：
1、目的
通过验证验证所采用的硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌法，适合于我公司硫乙醇酸盐流体培养基的制备，为质量控制试验提供优质培养基。并培养基配制和灭菌的操作法，为培养基配制和灭菌人员提供正确的操作法，使培养基配制和灭菌标准化、程序化。
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时使用，若保存在2～8℃，可在24 小时使用。
培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养三天，逐日观察结果。
结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
d.取同一批硫乙醇酸盐流体干粉培养基配制三批进行以下验证。
4.2.2.配制灭菌过程
a.称量 取硫乙醇酸盐流体干粉培养基29.25克,加纯化水1000ml,加热煮沸使其完全溶解。每次按照此处量配制8547ml。
b.灭菌前的pH值测定 取已配制好的硫乙醇酸盐流体培养基100ml，放冷至25℃调节PH值至7.2-7.4围。以此比例来调节剩下的培养基的pH值。
培养基无菌性试验
7.4.1 培养基配制及器具的灭菌
操作人：复核人：日期：
7.4.1.2 除菌过滤前TSB培养基微生物限度检验
检查依据：
微生物检查参照《微生物限度测定标准操作规程》（QC117）,采用薄膜过滤法.
营养琼脂培养基的配制：称取营养琼脂培养基干粉（中检所监制，批号：）g，加纯化水ml加热溶解。
检验用平皿的准备：准备直径90 mm的带盖玻璃平皿套，用牛皮纸包裹。
灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C, 30 min。
操作人：复核人：日期：
玫瑰红钠琼脂培养基的配制：称取玫瑰红钠琼脂培养基干粉（中检所生产，批号：）g，加纯化水ml，加热溶解。
检验用平皿的准备：准备直径90 mm的带盖玻璃平皿套，用牛皮纸包裹。
灭菌：以上培养基和物品统一灭菌，灭菌条件：121°C, 30 min。
操作人：复核人：日期：
Rodac碟培养基的的配制：称取胰酪胨大豆肉汤培养基干粉（上海中科，批号：）
g ，卵磷脂（国药集团，批号：）g，吐温80（批号：）
g，加入纯化水ml,微温使其溶解，用1.0M的氢氧化钠调节pH值使灭菌后为
7.3±0.2，加入琼脂g，加热使其溶解。
灭菌：灭菌条件：121°C, 30 min。
Rodac碟的批号：，生产厂商：，数量：。
操作人：复核人：日期：
取样用试管的准备：准备10 ml试管支，内装2 ml生理盐水和一根医用棉签，管口用医用纱布包裹的脱脂棉塞塞住，再用牛皮纸封口。
灭菌：灭菌条件：121°C, 30 min。
操作人：复核人：日期：
检查人：复核人：检查日期：报告日期：
7.4.1.4 除菌过滤器的膜完整性检测
无菌试验方法验证方案
一次性使用无菌医疗器械无菌试验
方法验证方案
编制：日期：
审核：日期：
批准：日期：
1.验证目的
通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。
2.样品信息
3.实验设备及器材
3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。
3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。
4.验证组成员及职责
姓名部门职责
品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准
品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施
品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作
5.验证依据
《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005
6.验证步骤
6.1检测设备计量有效性验证
确认以下设备经过校量并在有效期内
设备名称是否校验是否在有效期内备注
灭菌锅
洁净工作台
生物安全柜
电子天平
电热恒温箱
霉菌培养箱
确认人/日期：审核/日期：
6.2培养基适用性检查
6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。
表1
6.2.2灵敏度检查
6.2.2.1菌液制备方法描述
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
培养基配制和灭菌方法验证
培养基配制和灭菌方法验证
一、培养基配制
培养基是一种供养菌落生长的基础物质，可以提供细菌所需的营养物质和环境条件。培养基的配制是非常关键的步骤，如果配制不当会影响到培养菌落的生长和观察结果的准确性。
1.1固体培养基的配制
固体培养基是通过在液体培养基中加入凝固剂（如琼脂）使其凝固，形成固体的培养基。固体培养基可以用来分离纯菌、观察菌落特征以及保存菌种。
配制固体培养基的主要步骤如下：
步骤一：准备配方
根据不同的菌种需要，选择适当的培养基配方。常见的培养基如营养琼脂(NA)、大肠杆菌琼脂(MacConkey)、血琼脂(Blood Agar)等。
步骤二：计量和溶解
根据配方，按照适当的比例称量需要的成分，并加入适量的蒸馏水。然后，将成分加热溶解，直至成分完全溶解。
步骤三：凝固
将已溶解的培养基液倒入培养皿或试管中，装入适量的培养基液。温度下降至约50℃时，可以添加相应的抗生素(如青霉素)等，促进无菌条件的保持。待培养基液凝固后，即可进行灭菌处理。
1.2液体培养基的配制
液体培养基主要用于培养大量的菌落或进行革兰氏染色等实验。
液体培养基的配制步骤与固体培养基配制类似，只是不需要加入凝固剂。
为了确保培养基无菌，常常需要进行灭菌处理。
2.1常见的灭菌方法
常见的灭菌方法主要包括以下几种：
1)高压灭菌法：利用高温高压的环境，将培养基中的微生物逐一被杀死。常用的高压灭菌法是使用高压蒸汽灭菌器进行处理。
2)紫外线灭菌法：使用紫外线灭菌器，将细菌暴露在紫外线下，排除细菌生长的可能性。
3)化学灭菌法：使用化学物质，如乙醛、次氯酸钠等，浸泡培养基或在培养基上喷雾，杀灭细菌。
2015版药典培养基适用性验证
2015版药典培养基适用性验证
培养基验证文件
验证文件名称验证文件编码计数培养基适用性检查验证方案TS-YZ-2522-01
制药有限公司
制药有限公司
验证立项申请表
验证立项题目计数培养基适用性检查的验证立项编号TS-YZ-2522-01验证形式验证
立项部门质量部申请日期年月日验证对象计数培养基适用性
验证目的及验证内容
需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基是否适合需氧菌、霉菌及酵母菌数测定。
主管部门
审核意见
同意对计数培养基适用性检查试验方案进行验证。
年月日
对验证方案的编制及实施要求验证方案编制应科学，合理，方法应切实可行，实施必须按照方案进行。
验证总负
责人批准
经审核批准对计数培养基适用性检查进行验证。
签字：年月日
验证方案的审批
起草部门签名日期化验室
质量部
批准部门签名日期质量部
验证总负责人
验证方案目录
1、概述
2、验证目的
3、验证范围
4、验证项目小组成员及职责
5、验证合格标准
6、试验材料
7、菌液制备
8、适用性检查
9、验证记录
10、验证结论及综合评价
计数培养基适用性检查的验证方案
1. 验证目的：
需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基是否适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数测定。
2. 参照标准：《中国药典》2015年版四部1105非无菌产品微生物限度检查法。
3. 验证项目：胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基的适用性检查。
4.验证小组人员及职责：
微生物培养基配制及灭菌效果验证记录
□115 □121 □15 □20 □30
□115 □121 □15 □20 □30
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培养基名 称：
配制日期
微生物培养基配制及灭菌效果验证记录
生产批号 /生产日期
Leabharlann Baidu样品量(g) 配制量(mL)
灭菌温度 (℃)
灭菌时间(min)
□115 □121 □15 □20 □30
□115 □121 □15 □20 □30
□115 □121 □15 □20 □30
□115 □121 □15 □20 □30
LK-QC-014
LK-QC-014
LK-QC-014
LK-QC-014
LK-QC-014
LK-QC-014
LK-QC-014
实际 温度℃
是否合格
注：结果符合用“√”表示，不符合用“×”表示。
□115 □121 □15 □20 □30
□115 □121 □15 □20 □30
□115 □121 □15 □20 □30
培养基配制及适用性检查标准操作规程
目的：
建立培养基配制及适用性检查的标准操作规程，规范实验人员的操作流程。
范围：
适用于微生物检验人员对培养基的规范管理。
依据：
《药品生产质量管理规范（2010年修订）》、《中华人民共和国药典》2015年版第四部
职责：
1.微生物检验员：负责实验室所需求的培养基管理工作，使日常检验可以顺利进行。
2.微生物检验主管：负责对日常配制培养基的规范操作进行监督。
内容
1 培养基的申购
根据检验项目、工作量和工作进度的需求，提前一个月进行所需的培养基申购。申购时需指定培养基供应商，必要时进行供应商审计。
2 培养基的验收
2.1 培养基到货后，微生物室检验员应进行验收。验收内容包括核对品名、数量、规格、生产厂商，应与申购单一致；检查培养基包装有无破损、包装是否完整、产品是否在有效期内。
2.2 验收合格后，登记于《培养基领用台账》（附记录文件编号：SMP-10-QC-009-02（00））。
3 培养基的贮藏
3.1未开封的脱水培养基贮存于阴凉室，使培养基处于低温、干燥、和避光条件下。已
开封的脱水培养基应盖紧，贮存于阴凉库。
3.2灭菌好的培养基应进行预培养72h检查无菌后，置4～8℃冷藏保存待用。灭菌后
培养基储存期为7天。
4 培养基的配制
4.1培养基的配制和使用应填写《培养基配制及使用记录》（附记录文件编号：
SMP-10-QC-009-02（00））。
4.2培养基配制批号原则：原材料批号-配制日期：比如2011年1月1日配制的培养基，
培养基干粉批号000000，配制批号为:000000-110101。配制好的培养基贴《培养基标
培养基适用性检查验证方案
培养基适用性验证方案
编制：
审核：
批准：
1.验证目的：
本次验证的目的是确认无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查用培养基应进行培养基的适用性检查，符合灵敏度要求。
2.参照标准
2010版中国药典二部附录：XII A无菌检查法和XI G微生物限度检查法。
3.验证项目
无菌检查、微生物限度检查、控制菌检查用培养基的适用性检查。
5.前提条件确认
5.1所有本次验证实施过程中用到的仪器都已经过计量并且在计量有效期内。
5.2所有参与本次验证的公司人员均进行相关培训
6.接受标准
6.1.液体培养基促生长能力检査：被检培养基与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
6.2.液体培养基指示能力桧查：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。
6.3.固体培养基促生长能力检査：被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
6.4. 固体培养基指示能力检査：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
6.5.培养基抑制能力检査：试验菌应不得生长。
6.6.无菌性检查：应不得有菌生长。
6.7.适用性检查：被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且生长的菌落大小、形态特征应一致。
7.验证实施
7.1. 试验用仪器和物料
所用培养皿、移液管、工器具均应严格按照相关的灭菌程序灭菌；生物安全柜、灭菌器、霉菌培养箱、生化培养箱、水浴锅、电热鼓风干燥箱等。
7.3.验证用菌株
7.4.测试菌悬液菌液制备
●接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养
培养基的配制及质量控制课件(共44张PPT)
黑曲霉
[CMCC（F）98003]
检查方法
菌种
培养基
加入菌数 培养温度 培养时间
（cfu） （℃）
（h）
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌 胰酪大豆胨琼脂 50~100 30~35
48
枯草芽孢杆菌
黑曲霉
沙司葡萄糖琼脂 50~100 20~25 72
白色念珠球菌
菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，
若保存在2～8℃可以在24小时内使用。黑曲霉 孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期 内使用。
整个有效期内均需符合这些相应的标准。每批培养基储 存的时间将取决于一定存放条件（包括容器和密封性） 的培养基组成成分的稳定性。
试验结果处理
⑴当批培养基不符合促生长试验，应寻找造成不 合格的原因。
⑵这个调查包括采取适当的行动以防止问题的重 复出现。
⑶如果未找到原因或还没有解决有关培养基的促 生长问题，那么任何不符合要求的批次均不能使 用。
矫正pH 配制培养基必须矫正pH，干燥培养基也
必须对pH进行验证，高压灭菌前的pH应比最终 pH值高左右。矫正pH后的培养基应加热、过滤，
使培养基澄清。
2、培养基的灭菌
灭菌方法及条件不当可直接影响培养基质量，培 养基灭菌方法和条件,商品化的成品培养基或自配 的培养基若采用不适当的加热和灭菌条件，有可能 引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH的变
麦康凯液体培养基配制灭菌程序验证方案
麦康凯液体培养基配制灭菌程序验证方案
一、目的
验证微生物检测室购买的由广东环凯微生物科技有限公司生产的麦康凯液体培养基的配制和灭菌方法，验证该配制灭菌程序适合于检测室麦康凯液体培养基的配制和灭菌，为培养基配制和灭菌提供正确的操作方法，使培养基配制和灭菌标准化、程序化。
二、适用范围
麦康凯液体培养基的配制和灭菌
三、职责
1.技术负责人
1.1为验证组长，负责组织编写并审核验证方案及报告。负责组织方案及报告的执行。
2.检测室负责人
2.1负责验证方案的起草和方案的具体实施；负责验证过程的记录。
3.检测员
3.1负责验证方案的具体实施；负责验证过程的记录。
4.经理
4.1负责批准方案及报告。
四、作业标准
1.概述
培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。一般采用商品脱水培养基，临用时按使用说明或相关规定进行称量、配制、调节pH、分装、灭菌等。应按照生产商提供参数进行培养基的灭菌。
培养基若采用不适当的加热和灭菌条件，有可能引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH 的改变。因此，培养基应采用验证的灭菌程序灭菌,培养基灭菌方法和条件，应通过无菌性试验和促生长能力、抑制能力试验进行验证。灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。因此，应根据灭菌培养基的特性，进行全面的灭菌程序验证。本公司现在检验用培养基的灭菌方法均为湿热灭菌方法。
2.验证实施计划
年月至年月
3.培训
报告审批后，由验证小组组长对报告实施过程中涉及人员进行培训，以保证报告顺利实施，并做好培训记录，培训记录见附件1：《培训情况确认表》。
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天
第
6
天
第7天
第
8
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9
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第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
5.3.配制批号：日期：年月日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
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6
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9
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第
11天
第
12
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第
13
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14
天
结果
判定
6.灭菌后培养基灵敏度检查
6.1.菌液计数结果日期：年月日
指示菌名称
菌液浓度（cfu/ml）
3.2.《药品生产验证指南》（2003版）（国家食品药品监督管理局）
3.3.《药品生产质量管理指南》（2010版）
3.4.《中华人民共和国药典》（2010年版二部）
3.5.《中国药品检验标准操作规程》（2010年版）
4.验证方法与内容
4.1.实验准备
4.1.1.器具：电磁炉（最大功率2000W）、大烧杯（2000ml）、不锈钢锅、玻璃棒、25×250ml试管、硅胶塞、细绳、牛皮纸、分析天平、药匙、量筒（100ml、1000ml）等。
ABC
灭菌器柜门
D E
指示菌的放置：将指示剂嗜热脂肪芽孢菌（菌浓度：1.69×106cfu/支）5支各放入5捆培养基中间的其中一支试管，同时将已编号的5支校正好的留点温度计插入6支待灭菌培养基试管内，开始灭菌。
将已装载好的硫乙醇酸盐流体培养基在121℃条件下灭菌15分钟。灭菌结束后记录各留点温度计点温度。同时取出5支已灭菌嗜热脂肪芽孢菌，直接置56～60℃培养24～48小时，另取一支未经灭菌的嗜热脂肪芽孢菌指示剂一起培养，作为阳性对照。
15分钟
灭菌效果（F0值）
≥12
灭菌后pH值
6.9-7.3
灭菌后外观性状
符合规定
适用性检查
灵敏度检查
符合规定
无菌性检查
符合规定
有效期验证保存三周
外观性状
符合规定
灵敏度检查
符合规定
无菌性检查
符合规定
连续验证3次配制的硫乙醇酸盐流体培养基。
3.验证依据
3.1.SN/T1538.1-2005培养基制定指南
5.组织实施
5.1.验证机构的组成
5.2.公司验证委员会，负责所有验证工作的领导和组织、审批验证方案和验证报告、发放验证证书。
5.3.硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证工作小组，负责该验证项目的验证方案起草、实施、组织与协调实施，负责验证样品检测，完成各项记录，根据检验和验证结果进行评定、完成验证报告。
金黄色葡萄球菌管
铜绿假单胞菌管
生孢梭菌管
枯草芽孢杆菌管
6.3.培养基灵敏度检查结果日期：年月日
配制批号
检查项目
第一天
第二天
第三天
结果判定
阴性对照管
金黄色葡萄球菌管
铜绿假单胞菌管
生孢梭菌管
枯草芽孢杆菌管
6.4.培养基灵敏度检查结果日期：年月日
配制批号
检查项目
第一天
第二天
第三天
结果判定
阴性对照管
金黄色葡萄球菌管
5、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证附属记录
6、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证报告
7、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证合格证书
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法
验证计划
根据我公司认证领导小组的要求及验证委员会的安排，对硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法进行验证，具体安排如下：
一、年月日—年月日，制定验证方案，由硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证小组组长负责起草。
d.取同一批硫乙醇酸盐流体干粉培养基配制三批进行以下验证。
4.2.2.配制灭菌过程
a.称量取硫乙醇酸盐流体干粉培养基29.25克,加纯化水1000ml,加热煮沸使其完全溶解。每次按照此处方量配制8547ml。
b.灭菌前的pH值测定取已配制好的硫乙醇酸盐流体培养基100ml，放冷至25℃调节PH值至7.2-7.4范围内。以此比例来调节剩下的培养基的pH值。
名称
生产厂家
Baidu Nhomakorabea型号
校验情况
生化培养箱
电热恒温培养箱
自动台式灭菌器
电子天平
数字酸度计
生物安全柜
超净工作台
4.1.2.设备
4.1.3.培养基及试剂
名称
生产厂家
批号
纯化水
硫乙醇酸盐流体培养基
营养肉汤培养基
营养琼脂培养基
氢氧化钠
稀盐酸
嗜热脂肪芽胞菌（F0﹥12）
4.1.4.验证用菌株来源于贵州省药品检验所
验证菌株
部门
部门职责
责任人
工作划分
质量部
方案起草、实施、书写报告
操作实施
质量部
取样、检验、出报告
操作实施
验证
委员会
方案审定、批准、实施、发放验证合格证
方案审核
方案批准
4、附件及相关表格文件
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证报告
文件编码：
项目
姓名
签名
日期
起草
审核
审核
批准
生效日期
年份
1、验证概述
培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。
二、年月日—年月日，验证方案讨论、修改、审批和培训。
三、年月日—年月日，验证工作实施。
四、年月日—年月日，根据验证情况与记录，书写验证报告。
五、
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法
验证小组名单
组长：
成员：
1、目的
通过验证验证所采用的硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法，适合于我公司硫乙醇酸盐流体培养基的制备，为质量控制试验提供优质培养基。并培养基配制和灭菌的操作方法，为培养基配制和灭菌人员提供正确的操作方法，使培养基配制和灭菌标准化、程序化。
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
7.3.培养基无菌性检查结果配制批号：日期：年月日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
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第
6
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第7天
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9
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第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
8.保存三周后培养基灵敏度检查
配制批号
灭菌后指示剂颜色
结果判定
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
阳性对照
5.灭菌后培养基无菌性检查
5.1.配制批号：日期：年月日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
5.2.配制批号：日期：年月日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
根据培养基的特性，按制定的方法进行配制和灭菌，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行培养基的配制和灭菌，若不符合，重新制定方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证项目及认可标准
验证内容
验证项目
验证标准
配制
灭菌前的pH
7.2-7.4
灭菌
灭菌温度
121℃
灭菌时间
a.无菌性检查
每批培养基随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
b.灵敏度检查
菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
1.验证组织与实施
1.1.验证小组成员及职责分工
部门
部门职责
责任人
工作划分
质量部
方案起草、实施、书写报告
操作实施
质量部
取样、检验、出报告
操作实施
验证
委员会
方案审定、批准、实施、发放验证合格证
方案审核
方案批准
1.2.本验证由质量部负责并由相关人员根据《硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证方案》所规定的方法与步骤实施。
标准浓度
平板1
平板2
平均菌落数
金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]
＜100
铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]
生孢梭菌[CMCC(B) 64 941]
枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]
6.2.培养基灵敏度检查结果日期：年月日
配制批号
检查项目
第一天
第二天
第三天
结果判定
阴性对照管
c.分装将已调节好PH值的硫乙醇酸盐流体培养基分装至25×250ml试管中，分装的管数为190～200管范围，用牛皮纸按40管/捆的方式包扎结实。其中一管只装约20ml，以备灭菌后最终pH值测定。
d.灭菌器中的培养基的数量及装载方式（满载）
将分装好的5捆（40管/捆）培养基试管置于灭菌器中，按下图A、B、C、D、E 5点放置。
菌株代数
培养基
培养温度
培养时间（小时）
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
4.2.验证内容
4.2.1.执行标准
a.配制容器及配套器具的清洗严格按照《玻璃器皿清洗操作规程》执行。
b.培养基的配制严格按照《培养基管理规程》执行。
c.自动台式灭菌器严格按照《TMQ.R-3870型台式灭菌器使用维护保养操作规程》执行.
2.实施时间为：年月日—年月日。
2、各项目验证结论
1.灭菌前后pH值日期：年月日
配制批号
灭菌前pH值
灭菌后pH值
结果判定
2.外观性状
日期
年月日
年月日
结果判定
配制批号
灭菌后
保存三周后
3.留点温度计温度记录日期：年月日
配制批号
灭菌后温度℃
结果判定
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
4.指示剂培养结果日期：年月日
《中华人民共和国药典》2010年版二部规定：在实验室中，若采用已验证的配置和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。
本公司采用的培养基均是北京三药科技开发公司生产的市售脱水培养基。为规范生测实验人员在配制培养基时标准化、程序化并符合《中华人民共和国药典》2010年版二部规定，特对培养基的配制程序进行验证。
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证方案
文件编码：
项目
姓名
签名
日期
起草
审核
审核
批准
生效日期
年份
硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法
验证方案目录
1、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证计划
2、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证小组名单
3、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证方案
4、硫乙醇酸盐流体培养基配制和灭菌方法验证培训记录
根据颜色判断灭菌效果，培养后全部保持紫色灭菌合格。若由紫色变为黄色为不合格。对照管应由紫色变为黄色为该指示剂有效。
e.灭菌后的pH值的测定取20ml管已灭菌的硫乙醇酸盐流体培养基，放冷至25℃测定pH值，应在6.9-7.3范围内。
f.外观性状
灭菌后培养基应对其外观性状仔细检查，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。
铜绿假单胞菌管
生孢梭菌管
枯草芽孢杆菌管
7.保存三周后培养基无菌性检查
7.1.培养基无菌性检查结果配制批号：日期：年月日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
3
天
第4天
第
5
天
第
6
天
第7天
第
8
天
第
9
天
第10天
第
11天
第
12
天
第
13
天
第
14
天
结果
判定
7.2.培养基无菌性检查结果配制批号：日期：年月日
天数
编号
第
1
天
第2天
第
2、适用范围
本方案适用于本公司硫乙醇酸盐流体培养基的配制和灭菌方法的验证。
3、内容
1.概述
培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。
使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照培养基厂商提供的使用说明配制，如质量/体积、PH、制备条件、灭菌条件和操作步骤等。培养基若采用不适当的加热和灭菌条件，有可能引起颜色变化、透明度降低、PH的改变。因此，培养基应采用验证的灭菌程序灭菌，培养基灭菌方法和条件，应通过适用性检查试验进行验证。此外，对高压灭菌器的蒸汽循环系统也要加以验证，以保证在一定的装载方式下的正常热分布。温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基的过热，过度灭菌可能会破坏绝大多数的细菌和真菌培养基促生长的质量。灭菌器中的培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。因此，应根据灭菌培养基的特性，进行全面的灭菌程序验证。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养三天，逐日观察结果。
结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
贮存中培养基发生颜色变化、浑浊；固体培养基表面产生裂缝或涟漪等异常现象，不符合使用规定时，应停止使用，重新进行配制和灭菌程序验证。
4.2.3.硫乙醇酸盐流体培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。