第九章原生质体

(2)诱发融合(induced fusion)： 指应用某种诱变剂导致原生质体融合的方法。
(1)异核体或异核细胞：细胞质发生融合，但细胞核 未融合，两个核处在共同细胞质中，这种现象称 为异核体或异核细胞。 (2)杂种原生质体或合子细胞：双核异核体的细胞核 发生融合产生的杂种细胞称为杂种原生质体或合 子细胞。 (3)同核体：两个相同原生质体发生融合，则为同核 体。 (4)非对称杂种或细胞质杂种：异核体中的两个细胞 核，若亲缘关系太远，其中一个核的染色体逐个 被排除掉，这种细胞为非对称杂种。如果整个核 完全消失，细胞质仍为杂合，这种融合产物叫细 胞质杂种。
国内常用EA3-867酶 一种复合酶，其成分含纤维素酶、半纤维素 酶、果胶酶。EA3-867复合酶有害成分少， 优于日本R-10纤维素酶。 蜗牛酶和胼胝质酶 用于花粉母细胞和四分孢子的原生质体分离， 因为花粉细胞和四分孢子外有胼胝质壁， 用其他酶效果较差。
原生质体的 分离
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分离的原 生质体
优点：酶解法可以获得大量的原生质体，而 且几乎所有植物或它们的器官、组织或细 胞均可用酶解法获得原生质体。
2．原生质体体培养的意义
1）单细胞无性系的建立：通过原生质体培养 可以产生单细胞无性系(monocell clone)， 而单细胞无性系为在细胞水平上进行突变 体的筛选、次生代谢物生产、人工种子 (artificial seed)生产、种质资源库的建立等 提供了非常理想的受体系统。
2）遗传转化的良好受体：原生质体无细胞壁， 易于摄取外源遗传物质、细胞器、微生物 等，为植物基因工程研究提供了理想的遗 传实验操作体系。
培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一 定影响。温度过高，原生质体被杀死或灼 伤；温度太低，培养基凝固迅速，原生质 体分散不均匀，影响细胞的追踪观察。
固体中单细胞生活能力弱，透气状况不良， 第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。
2.浅层液体培养法
在培养皿或三角瓶中注入3-4ml原生质体培 养液，然后将纯净的原生质体，按一定 细胞密度注入并进行培养。
木本植物体细胞分离原生质体
由于细胞壁的构成与草本植物有所不同，因 此其混合酶液的组成和浓度与草本植物有 差异。分解木本植物细胞壁，纤维素酶是 不可缺少的，其浓度范围与草本植物相同， 但果胶酶的使用比草本植物更普遍(见上表)。
成熟花粉粒和四分体小孢子由于细胞壁中含有胼胝 质层，原生质体分离时除需纤维素酶类和果胶酶 类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶， 其浓度为0.5％-2％)。
渗透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植 物种类而异：
4.质膜稳定剂
质膜稳定剂的作用：增加完整原生质体数 量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁 再生和细胞分裂形成细胞团。 常用的原生质膜稳定剂：葡聚糖硫酸钾浓 度0.2％-0.3％、MES[2-(N-码琳)-乙烷磺 酸](弱酸)、氯化钙浓度0.1-1.0mmol／L 磷酸二氢钾。
分离的原 生质体
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三、原生质体活力测定
1．形态识别 形态上完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形原 生质体为有活力原生质体。如果进一步将其转入 低渗培养液或洗涤液中，可见到分离操作中被高 渗溶液缩小了的原生质体会恢复原状，这种正常 膨大的原生质体即为有活力的原生质体。 2．相差显微镜观察法 在相差显微镜下观察细胞质环流和正常细胞核的存 在与否来鉴别细胞的活性。 3．酚藏花红染色法 酚藏花红(phenosafranine)能使无活力的原生质体染 成红色，有活力的原生质体不着色。酚藏花红的 浓度为0．1％。
缺点 优 点
获得完整的原生质体的数量比较少，能够用 此法产生原生质体的植物种类受到限制。 该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
2.酶解分离法
用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生质体的方法。
原生质体分离常用的酶种类： 纤维素酶类 纤维素酶(cellulase) 半纤维素酶(hemicellulase) 崩溃酶(driselase) 果胶酶类 果胶酶(pectinase) 离析酶(macerozyme) 蜗牛酶(snailase) 胼胝质酶(callosease)等。
四、影响原生质体数量和活力的因素
1．供试材料 （1）自然生长材料的幼嫩叶片 （2）无菌实生苗子叶和下胚轴 （3）外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培 养物 （4）花粉细胞
2．酶的种类、组合和酶解时间
野大麦幼穗原生质体的分离
草本植物体细胞分离原生质体
利用纤维素酶类和果胶酶类中的2～3种酶组 合成的混合酶液即可达到原生质体分离的 目的，纤维素酶浓度一般为0.5％-3％，果 胶酶浓度为0.1％-1％(见上表)。
界面法
这种梯度的制备方法：
离心管中先加入溶于培养基中500mmol/L蔗糖。 加入溶于培养基中的140mmol/L蔗糖和360mmol ／L山梨醇。 最后一层是悬浮在酶液中的原生质，其中含有 300mmol/L山梨醇和100mmol/LCaCl2。 经400g、5min离心后，在蔗糖层上出现一个纯净 的原生质体层，而碎屑则位于管底。
五、原生质体培养及其技术关键
（一）原生 质体培养 方法
1.固体薄层培养法(平板培养法)
指将一定体积(3-4ml)的原生质体按照一定细胞密 度(104-105个细胞/L)与等体积的处于45℃的琼 脂培养基混合，在培养皿内制成薄层(1mm)固 体平板的方法。
优点：这种培养方法使原生质体处于固定位置， 避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原 生质体由细胞壁再生及细胞团形成的全过程进 行定点观察。
由于脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原 生质体的过程一般是在黑暗条件下进行的。
胡萝卜：25℃保温2h，原生质体开始释放， 保温10-121h，原生质体大量释放。 月季：25-33℃ ，保温24h。 柑橘：37℃ ，保温2-4h。 蚕豆：28—30℃，保温1-3h。 烟草：26℃，黑暗保温1h(四分体)、2.5h(成 熟花粉)。
细胞壁降解酶的种类和组合 ： 例：叶片及其培养细胞：纤维素酶和果胶酶 根尖细胞：以果胶酶为主附加纤 维素酶或粗制 纤维素酶 花粉母细胞和四分体期小孢子：蜗牛酶和胼胝 质酶 成熟花粉：果胶酶和纤维素酶
3.渗透压稳定剂
用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破 坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微 弱的质、壁分离状态，有利于完整原生质体的释 放。把这种高渗液称为渗透压稳定剂。 常用的渗透压稳定剂： 甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类(KCl， MgSO4· 20)等。 7H 在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合 使用。通常用渗透压稳定剂稀释酶制剂、渗压压 稳定剂中，用得最多的是甘露醇。
缺点：酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧 化物酶以及酚类物质。 用酶法降解细胞壁，会影响所获原生质体的 活力。酶解法分离原生质体要注意根据植 物种和该种类植物细胞壁的结构，选择酶 种类和酶浓度。
实例 胡萝卜(悬浮培养细胞)： 1％纤维素酶， 0.5％半纤维素酶 月季(悬浮培养细胞)： 3％纤维素酶 柑橘(胚愈伤组织)： 蚕豆(根尖)： 5％EA-867复合酶 2％EA-867复合酶
第九章 原生质体培养和细胞融合
教学目的和要求：
(1)了解原生质体培养的意义。 (2)掌握原生质体分离的大致步骤。 (3)掌握原生质体培养的方法。
第一节 植物原生质体培养和体细胞杂交 的概念及意义
一、原生质体培养的概念及意义 1．原生质体培养的概念： （1）原生质体（Protoplast） Hamstein（1880） 指的是“被去掉细胞壁的由质膜包裹着的，具有生活力 的裸细胞”。 （2）原生质体培养（protoplast culture） 给予游离出的植物原生质体适当的培养条件，使之重新 形成细胞壁，并开始分裂增殖直至分化形成再生植株 的过程。
3）多种基础研究的实验体系：利用原生质体 可以进行基础理论的研究，如细胞生理、 基因调控、分化和发育、细胞质膜结构和 功能、植物细胞壁再生、病毒侵染机理等 方面研究。 4）体细胞杂种的形成：由于细胞壁被溶解， 有利于细胞间相互融合，克服了常规育种 中远缘种属间由于生殖隔离而造成的杂交 障碍，实现了远缘种属间遗传信息的交流。
烟草(花粉)四分体孢子：2％果胶酶 1％蜗牛酶(降解胼胝质壁)
成熟花粉： 1％；1.5％பைடு நூலகம்胶酶； 2％纤维素酶
二、原生质体纯化
1.沉降法
利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中， 先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的 原生质体沉积于试管底部。
优缺点：沉降法纯化原生质体比较简单。但 由于原生质体沉积在试管底部，造成相互 间的挤压，常引起原生质体的破碎。
原生质体 融合的不 同产物
2．体细胞杂交的意义
（1）细胞膜和细胞器行为的研究：
（2）染色体行为的研究：
（3）远缘杂种的形成：
第二节 植物原生质体的培养
一、原生质体的分离方法 1.机械分离法 先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻 微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械 法磨碎组织，从伤口处可以释放出完整的原生质 体。用这种方法曾成功地分离出藻类原生质体。
分离原生质体时，酶液的pH值，因植物种 类不同而有差异。
如 胡萝卜pH值＝5.5 月季pH值＝5.5-6.0 烟草pH值=5.4-5.6 柑橘pH值=5.6 蚕豆pH值＝5.6-5.7
6．光照和温度的影响
酶活力与温度也有关系，分离原生质体所用 的各种酶的最适温度是40-50C，但这种温 度细胞无法适应。分离原生质体所用的温 度一般为25-30℃。
5.pH值对原生质体数量和活力的影响
酶活性与pH有关。酶活力和细胞活力最适pH不 完全一致，如纤维素酶R-10和离析酶R-10的最 适pH分别为5-6和4-5，而细胞活性的pH一般 为5-6。
低pH值下(pH值＜4.5）：酶的活力强，原生质体 分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多； pH值偏高：酶活力差，原生质体分离速度慢完 整的质体数目较多。