原生质体转化
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化是一种生物技术，旨在将外源DNA引入宿主细胞以获得特定的遗传性状态或表观遗传变化。
原生质体转化原理是一种利用外源DNA（例如体外克隆的DNA和质粒）彻底改变宿主细胞的生理特性。
它为研究者提供了一种简便的方法来改变宿主细胞的遗传特性，同时也能够可靠地测定插入外源DNA的效果。
原生质体转化可以用于实验检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化是一种简易的、可重复的、可控的、有效的技术，可以用来利用外源DNA改变宿主细胞的生理表型，插入和表达外源DNA成为宿主细胞的一部分。
原生质体转化可以被用来驱动各类基因的表达，修改受体的结构，调控蛋白质表达。
原生质体转化是一种可以用来将外源DNA进行插入的非常有效的技术，其优势在于很多具有特定功能的DNA可以被插入宿主细胞，可以较快的检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化依赖于抗生素耐受性，以及抗性转录因子的表达。
这种抗生素耐受机制通过一系列复杂的交互作用使宿主细胞能够耐
受特定的抗生素，该抗生素是质粒DNA的载体，从而达到对特定DNA 序列的特异性。
另外，原生质体转化还可以依赖于转录抑制因子的表达，如亢余的转录抑制因子，以防止宿主细胞的表达被抑制，并保持外源DNA的表达稳定。
总而言之，原生质体转化是一种简便而可靠的技术，可以用来改变宿主细胞的遗传特性，实现对基因功能的检测，以及研究调控机制的功能。
原生质体转化原理
原生质体转化原理原生质体转化是一种重要的基因工程技术，它被广泛应用于生物学研究和生物技术领域。
原生质体是细胞膜和细胞壁之外的细胞质，是一种裸露的细胞质体。
在细菌和植物细胞中，原生质体是一种具有自主活动能力的细胞器，它能够在细胞内外自由运动，承担着许多重要的生命活动。
而原生质体转化则是利用原生质体的自主活动能力，将外源基因导入目标细胞内部，实现基因转移和表达的过程。
原生质体转化的原理和过程原生质体转化的原理是利用高浓度的离子溶液和渗透剂，在低温条件下使原生质体发生体积缩小和形态变化，从而使其细胞膜和细胞壁发生裂解，形成空泡。
在此基础上，将外源基因导入空泡内部，利用渗透剂的作用，使基因与空泡内的原生质体结合并进入目标细胞内部。
随后，通过一系列的复杂生化反应，外源基因被整合到目标细胞的染色体中，并被转录和翻译为蛋白质，实现基因表达。
原生质体转化的应用原生质体转化技术可以被广泛应用于生物学研究和生物技术领域。
在生物学研究中，原生质体转化技术可以用于基因功能研究、基因组编辑和细胞工程等方面。
在生物技术领域，原生质体转化技术可以用于生物制药、农业生产和环境保护等方面。
在生物制药中，原生质体转化技术可以用于生产重组蛋白、抗体和疫苗等生物制品。
通过将外源基因导入目标细胞中，可以实现大规模生产高纯度的生物制品，从而满足临床和市场上的需求。
在农业生产中，原生质体转化技术可以用于改良植物品种、提高作物产量和抗病性等方面。
通过外源基因的导入，可以实现对植物基因组的编辑和修饰，从而实现对植物性状的调控和优化。
在环境保护中，原生质体转化技术可以用于生物降解和生物修复等方面。
通过导入外源基因，可以实现对细菌和微生物的基因编辑和改造，从而提高其对环境污染物的降解和修复能力，为环境保护和生态建设提供有力支持。
原生质体转化是一项重要的基因工程技术，它为生命科学和生物技术领域的发展提供了强有力的支持。
随着技术的不断创新和发展，相信原生质体转化技术将会在更广泛的领域发挥更加重要的作用。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
水稻原生质体制备及转化方法
原生质体制备及转化1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。
然后用2.5%的次氯酸钠消毒20 min。
用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。
4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。
用手充分摇晃10s。
7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。
8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀13.28℃避光静置转化20--25min14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。
15.重复步骤1416.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液18.共聚焦显微镜观察拍照配制溶液方法：酶液W5溶液MMG溶液PEG(5mL)。
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
原生质体转化原理
原生质体转化原理原生质体转化是一种重要的基因工程技术，它可以将外源基因导入植物细胞内，实现基因的转移和表达。
原生质体转化原理主要包括以下几个方面，构建适当的载体、选择合适的植物细胞、利用适当的方法导入外源基因、筛选和鉴定转化植株。
下面将对这几个方面进行详细介绍。
首先，构建适当的载体是原生质体转化的关键步骤之一。
载体是用来携带外源基因的DNA分子，一般包括表达载体和转座载体。
表达载体可以使外源基因在植物细胞内得到表达，转座载体则可以使外源基因插入到植物基因组中。
构建适当的载体需要考虑外源基因的大小、表达强度、选择标记等因素，确保外源基因能够在植物细胞内得到稳定的表达。
其次，选择合适的植物细胞也是原生质体转化的重要环节。
不同的植物种类、不同的组织和细胞类型对于外源基因的转化和表达具有不同的适应性。
选择合适的植物细胞需要考虑细胞的分化状态、再生能力、易于培养等因素，以确保外源基因能够被稳定地转化和表达。
接下来，利用适当的方法导入外源基因是原生质体转化的关键步骤之一。
常用的方法包括生物弹射法、凝胶载体法、冷冻法等。
这些方法可以有效地将外源基因导入植物细胞内，实现基因的转移和表达。
选择合适的方法需要考虑细胞的特性、外源基因的性质、转化效率等因素，以确保外源基因能够被高效地导入植物细胞内。
最后，筛选和鉴定转化植株是原生质体转化的最后一步。
筛选转化植株需要利用适当的选择标记和筛选条件，鉴定转化植株需要利用PCR、Southern blot等技术手段进行分子分析和表型分析，以确保转化植株中外源基因的稳定性和表达性。
总之，原生质体转化原理涉及到载体构建、植物细胞选择、外源基因导入、转化植株筛选和鉴定等多个环节，每个环节都对转化效率和稳定性具有重要影响。
只有在每个环节都做到科学合理、精心设计，才能够实现外源基因的高效转化和稳定表达，为植物基因工程研究提供强有力的技朮支持。
原生质体的提取及在遗传转化方面的应用
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原生质体转化技术在作物育种中的应用
原生质体转化技术在作物育种中的应用随着人口的增加和城市化进程的加快，粮食安全、种质资源保存和气候变化适应等问题日益凸显，作物育种技术成为农业发展的关键所在。
其中，原生质体转化技术作为现代生命科学和生物技术发展的重要分支，在作物育种中不断发挥着重要作用。
一、原生质体转化技术的概述原生质体是由生物细胞内外液体共同构成的一种流动物质。
原生质体转化技术是指将某些异细胞（不同物种之间或同一物种不同基因型之间的细胞）的原生质体与目标细胞接触，使其进入目标细胞内并与其细胞质融合，从而实现某种目的的技术手段。
这种技术通常需要利用某些特定的物理和化学作用进行操作，例如：化学转化、射线辐射、电孔法或枪击法等技术方法。
二、1. 无性繁殖通过原生质体转化技术，可以实现某些作物无性繁殖的目的。
例如，单倍体植株可以通过原生质体转化技术获得，而单倍体植株又可以通过孕穗法进行繁殖，进而大幅提高种质资源的利用效率和种源创新的速度。
同时，这种技术还可以为杂交、重组和选择育种各个环节提供高效的基础。
通过基因组重组或选择性生殖等方法，获得携带特定基因型的植株中，可以更高效地利用原生质体转化技术。
2. 基因组编辑随着基因组编辑技术的发展，原生质体转化技术在作物育种中的应用也逐渐得到了拓展。
例如，利用CRISPR/Cas9这样的基因编辑技术，可以针对作物基因组中的某些通过传统技术很难修饰的基因进行修饰，从而增强作物的耐逆性、产量等性状。
3. 质量改良在作物的产量、品质和抗逆性中，热潮胁迫对于作物生长和发育的影响尤为重要。
通过原生质体转化技术，可以将抗热/耐旱性基因导入目标作物的基因组中，达成质量改良的目的。
另外，在商业种植中，适应性强、生长快、产量高的作物品种更受到农民的欢迎。
基于原生质体转化技术所实现的杂交、重组和选择性生殖等技术，可以更加有效地实现种质资源的优化和创新，推进育种、选育和优选等方面的工作。
三、结论总的来说，原生质体转化技术可以为作物育种工作提供高效的手段，并提供由孕穗、基因编辑、质量改良等方面的多重选择器，帮助作物育种者更加有效地完成作物品种资源的开发和培育，进而在现代农业发展进程中发挥着越来越重要的作用。
原生质体转化原理
原生质体转化原理原生质体转化是一种重要的生物技术手段，它可以帮助我们将外源基因导入到目标细胞中，为基因工程和生物学研究提供了重要的工具。
在原生质体转化中，原生质体被用作外源DNA的载体，通过一系列的转化步骤，外源基因最终被导入到目标细胞中，并表达出相应的蛋白质。
本文将介绍原生质体转化的原理及其相关的关键步骤。
首先，原生质体转化的关键原理是利用细菌的自然转化能力。
细菌在自然界中可以通过水平基因转移的方式，将外源DNA导入到其细胞内，并将其整合到自身基因组中。
这种自然转化的原理被应用到实验室中，通过一系列的操作，将外源DNA导入到目标细胞中。
其次，原生质体转化的关键步骤包括制备原生质体、转化、筛选和鉴定。
首先，需要从细菌中提取原生质体，这可以通过裂解细菌细胞获得。
接下来，将外源DNA与原生质体进行连接，形成重组质粒。
然后，将重组质粒导入到目标细胞中，使其在目标细胞内复制和表达。
最后，通过特定的筛选方法，筛选出带有外源基因的目标细胞，并通过鉴定确认外源基因的导入和表达。
另外，原生质体转化的成功与否受到多种因素的影响。
其中，原生质体的构建质量、目标细胞的转化能力、外源基因的选择等都会影响转化效率。
因此，在进行原生质体转化实验时，需要对各个步骤进行精细的优化，以提高转化效率和成功率。
总的来说，原生质体转化是一种重要的生物技术手段，它为基因工程和生物学研究提供了重要的工具。
通过理解原生质体转化的原理和关键步骤，我们可以更好地应用这一技术，实现外源基因的导入和表达，为生命科学研究和生物技术应用提供有力支持。
希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解原生质体转化的原理和应用，为相关研究和实验提供参考和指导。
拟南芥原生质体转化
拟南芥原⽣质体转化在短⽇照，相对低光和⾼湿的条件下种苗⼦。
（10-13 h light at 23°C/11-14 h dark at 20°C）（50-75µmol m-2 S-2），湿度40-65%。
选择3-4周的苗⼦，没有开花，没有胁迫，⼀般第5-7⽚真叶已经完全展开。
选取第5,6,7⽚真叶，⽤锋利的⼑⽚切下，在实验台上，先把叶⽚的边缘切掉，然后将叶⽚的中间部分切成0.5-1mm 的细条，将切好的细条两⾯都沾到酶解液，浸泡到酶解液Enzyme solution中。
28°C⿊暗消化叶⽚5 h。
⼀般10⽚叶⽚⾜够做20个样品的。
向消化好的叶⽚中加⼊等体积的W5 solution（10 ml 酶解液加10 ml W5），轻轻混匀，⽤筛⼦将消化的原⽣质体过滤到50ml的圆底离⼼管中。
4°C，200 g，soft离⼼2 min，使原⽣质体沉到管底，去除上清，轻轻旋转离⼼管，使原⽣质体分散。
（⼤离⼼机上升下降的加速度设成5）.沿管壁向原⽣质体中缓缓加⼊5 ml的W5 solution，轻轻混匀后，冰上放置30 min，使原⽣质体靠重⼒沉降。
尽量去除上清，但不要碰到原⽣质体的沉淀，之后加⼊样品需要体积的MMG solution。
轻轻混匀，冰上放置。
分装10 µl质粒到2 ml的圆底离⼼管中，加⼊100 µl的原⽣质体，轻轻拨匀，之后沿管壁轻轻加⼊110 µl预先配好的PEG-calcium transfection solution，轻轻拨匀。
室温静置5-15 min。
向管中加⼊400-440 µl的W5 solution，轻轻颠倒混匀，终⽌转化反应。
RT，100 g，soft 离⼼2 min，之后去除上清。
⽤1 ml的W5 solution重悬原⽣质体。
将离⼼管放到光下培养过夜。
光下培养有利于某些基因的表达，但强光会破坏原⽣质体的⽣长，最后在培养的时候上⾯盖上两层卫⽣纸。
拟南芥原生质体转化
2.2.7 拟南芥原生质体制备制备酶解液10 ml1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。
（用胶带把下表皮沾掉，效果更好。
放一小培养皿里面降解）2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养3 h-4 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。
3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。
4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。
（冰上）5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。
6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。
（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5）7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。
8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积MMg中。
（看细胞浓度而定）9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。
2.2.8 原生质体转化1．在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。
（3=1+2）2．上述混合物室温放置10-30 min。
3．反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。
4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。
5．加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。
6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。
7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。
2. 酶解液10ml在一个10ml试管中分别加入下列组分Cellulase R10 0.15 gMacerozyme R10 0.04 g200mM MES pH5.7 1 ml200mM KCl 1 mlD- Mannitol 0.728 g1 M CaCl2100 µl加ddH2O至10 ml（0.45um过滤）Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma3. W5培养基50 ml在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分2M NaCl 3.85 ml200mM KCl 1.25 ml200mM MES 0.5 ml1M CaCl2 6.25 ml加ddH2O至50 ml4. MMg培养基10 ml在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分D-Mannitol 0.728 g150mM MgCl2 1 ml200mM MES pH5.7 200 µl加ddH2O至10 ml5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分PEG4000 4 gD-Mannitol 0.364 g1M CaCl2 1 ml加ddH2O至10 ml。
原生质体制备和转化
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离 心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单 孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝 培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原 生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
文献汇报
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汇报人姓名
培养基成分 高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。
水稻原生质体分离及转化
水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。
溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2•2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。
2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
原生质体转化效率低的原因
原生质体转化效率低的原因《原生质体转化效率低的原因》原生质体转化是一种广泛应用于生物学和基因工程领域的技术，可用于引入外源基因、突变的基因或双链RNA等到植物细胞中。
然而，实践中发现，原生质体转化效率往往不高，这在一定程度上影响了该技术的应用。
本文将探讨一些导致原生质体转化效率低的原因。
首先，细胞壁的存在是导致原生质体转化效率低的一个重要因素。
细胞壁是由多糖和蛋白质组成的坚硬结构，起到维持细胞形态和结构的作用。
然而，细胞壁的存在使得原生质体难以进入植物细胞内部。
即使通过酶解细胞壁来增加通透性，也能引入细菌或其他污染物进入细胞，进而破坏细胞的正常生理过程。
其次，植物细胞内源性酶的存在也会影响转化效率。
细胞内酶的功能是降解外源DNA，防止其进一步整合到基因组中。
这种酶的活性会限制外源DNA进入细胞核，使得原生质体转化效率降低。
虽然可以通过抑制酶的活性来提高转化效率，但这也会带来其他副作用，如对细胞核的损伤。
此外，原生质体的来源也直接影响到转化效率。
原生质体从植物细胞中分离出来后，需要经历多个步骤的处理和培养，如去除细胞壁、质体维持培养、饱和点脉冲培养等。
这些过程对原生质体的活性和稳定性有要求，若操作不当或处理过程中存在问题，将直接影响转化效率。
最后，外源DNA的形式和性质也会对转化效率产生影响。
大多数情况下，外源DNA以线性形式存在，容易被细胞内酶降解，从而减低了其转化效率。
此外，过长或过短的外源DNA也会影响其进入细胞核的能力。
综上所述，《原生质体转化效率低的原因》主要包括细胞壁的存在、细胞内酶的活性、原生质体的处理和培养过程，以及外源DNA的形式和性质。
针对这些问题，科研人员需要制定更合适的转化策略和方法，以提高原生质体转化效率，从而更好地开发和利用这一技术。
小麦原生质体分离及转化实验方法
小麦原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片100um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备小麦苗的培养，种小麦种子于培养室，置于温度25±2℃，光照度1000Lx，光照14～16h/d 的条件下培养。
先光照培养7天再暗培养7-10天。
3.原生质体分离（1）取小麦幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成0.5-1mm的丝，放入0.6M 的Mannitol溶液中避光处理10分钟，再用滤网过滤，将其放入50ml酶液中消化5小时（先静止酶解0.5h，再10rmp缓慢摇晃4.5h）。
（注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
）（2）加10ml W5稀释酶解产物，用100um尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中（50ml）。
（注：尼龙滤膜要浸泡在75%酒精里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min 再过滤。
）（3）23℃，80g，升3降3，离心3min，弃上清。
（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（4）用W5 10ml 轻轻悬起，23℃，80g，升3降3，离心3min，弃上清。
（5）用W5 10ml 轻轻悬起冰上放置30min，原生质体逐渐沉降，23℃，80g，升3降3，离心3min，弃上清。
（6）加适量MMG悬浮，至于冰上，待转化。
（注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检（×100），原生质体数为2×105 /ml---1×106 /ml. 吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害。
）4.小麦原生质体转化（1）加20ug质粒于10ml离心管，用去尖的枪头吸取200ul原生质体轻弹混匀，静止3-5min，再加200ul PEG4000，轻弹混匀，避光诱导转化10min；（2）加1760ul W5（室温）颠倒混匀，80g，升3降3，离心3min，弃上清；（3）加1ml W5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1ml W5，23℃培养过夜。
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拟南芥原生质体制备
制备酶解液10 ml
1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。
（用胶带把下表皮沾掉，效果更好。
放一小培养皿里面降解）
2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养2 h-2.5 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。
3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。
4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。
（冰上）
5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。
6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。
（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5）
7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。
8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积Mamg中。
（看细胞浓度而定）
9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。
2.2.8 原生质体转化
1．在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。
（3=1+2）
2．上述混合物室温放置10-30 min。
3．反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。
4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。
5．加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。
6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。
7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。
2. 酶解液10ml
在一个10ml试管中分别加入下列组分
Cellulase R10 0.15 g
Macerozyme R10 0.04 g
200mM MES pH5.7 1 ml
200mM KCl 1 ml
D- Mannitol 0.728 g （4ml 1M的甘露醇）
1 M CaCl2100 µl
加ddH2O至10 ml（0.45um过滤）
Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma
3. W5培养基50 ml
在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分
2M NaCl 3.85 ml (或0.45g)
200mM KCl 1.25 ml
200mM MES 0.5 ml
1M CaCl2 6.25 ml
加ddH2O至50 ml
4. Mamg培养基10 ml
在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分
D-Mannitol 0.728 g （4ml 1M的甘露醇）
150mM MgCl2 1 ml
200mM MES pH5.7 200 µl
加ddH2O至10 ml
5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分
PEG4000 4 g
D-Mannitol 0.364 g （2ml 1M的甘露醇）
1M CaCl2 1 ml
加ddH2O至10 ml
实际只需配制：1 ml PEG4000 4 g
D-Mannitol 0.364 g （2ml 1M的甘露醇）
1M CaCl2 1 ml
加ddH2O至1 ml。