原生质体转化

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拟南芥原生质体制备

制备酶解液10 ml

1.取幼嫩拟南芥叶片,使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。

(用胶带把下表皮沾掉,效果更好。放一小培养皿里面降解)

2.材料侵入10 ml酶解液中,暗培养2 h-2.5 h,至原生质体完全从叶片上解离下来。

3.酶解结束后轻轻晃动溶液,镜检酶解结果。

4.使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。(冰上)

5.100×g,4℃,离心2 min,收集原生质体。

6.重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中,100×g离心2 min,收集原生质体,(重复三次)。(重悬时,先加入少些W5轻轻悬起原生质体,随后再轻轻加入剩W5)

7.重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中,冰浴30 min。

8.100×g离心2 min,收集原生质体,重悬原生质体于1/10体积Mamg中。(看细胞浓度而定)

9.取少量重悬原生质体镜检,其余用于转化或4℃保存一周内使用。

2.2.8 原生质体转化

1.在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl,大小在5 Kb之内),100 µl原生质体,充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。(3=1+2)

2.上述混合物室温放置10-30 min。

3.反应结束后加入440 µl W5液体培养基,充分混匀。

4.100×g离心2 min,收集原生质体,移除上清。

5.加入500 µl W5溶液培养基,100×g离心2 min,收集原生质体,(重复一次,可以重复两次)。

6.重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中,在细胞培养板中,24℃黑暗培养。7.取黑暗培养18 h后的原生质体,加入荧光素底物,使用CCD照相成像保存。

2. 酶解液10ml

在一个10ml试管中分别加入下列组分

Cellulase R10 0.15 g

Macerozyme R10 0.04 g

200mM MES pH5.7 1 ml

200mM KCl 1 ml

D- Mannitol 0.728 g (4ml 1M的甘露醇)

1 M CaCl2100 µl

加ddH2O至10 ml(0.45um过滤)

Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了,其他药品都是sigma

3. W5培养基50 ml

在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分

2M NaCl 3.85 ml (或0.45g)

200mM KCl 1.25 ml

200mM MES 0.5 ml

1M CaCl2 6.25 ml

加ddH2O至50 ml

4. Mamg培养基10 ml

在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分

D-Mannitol 0.728 g (4ml 1M的甘露醇)

150mM MgCl2 1 ml

200mM MES pH5.7 200 µl

加ddH2O至10 ml

5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分

PEG4000 4 g

D-Mannitol 0.364 g (2ml 1M的甘露醇)

1M CaCl2 1 ml

加ddH2O至10 ml

实际只需配制:1 ml PEG4000 4 g

D-Mannitol 0.364 g (2ml 1M的甘露醇)

1M CaCl2 1 ml

加ddH2O至1 ml

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