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菌落PCR PCR实验技术

菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。

是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。

操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。

操作方法：
1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。

现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟
3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。

退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低
5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
方法细节：
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。

在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。

这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。

当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。

想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。

菌落PCR

菌液PCR的经验已有578 次阅读 2013-6-19 11:27 |系统分类:科研笔记由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性。

我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定。

结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）。

也难怪老板一口回绝，只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命。

后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6，因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P 出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

6菌落PCR_2012年分子生物学实验

6.1.2【实验原理】
以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模
板3’末端引物存在的条件下,利用酶进
行互补链的延伸。经变性、退火和延伸
多次循环能使微量的模板DNA得到极大程
度的扩增。
6.1.2【实验原理】典型PCR反应体系的组成
模板DNA
引物:与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补DNA（20个左右碱基的短DNA单链)
•
电泳:110V电泳30min。
注意事项
避免污染低温操作正确选择温度正确设置程序
思考题

PCR中如果出现非特异的条带，可能是哪些方面出现问题，应该如何调整？
下次实验
重组克隆子的酶切鉴定
4、琼脂糖电泳检测
① 制胶: 配置25ml 1%琼脂糖凝胶(2人配一块胶,使用 11个小齿的梳子)。（不知道如何配置的同学问老师）
② 上样电泳:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. A1(1#) A1(2#) A1(3#) A1(-) DNA Marker A2(1#) A2(2#) A2(3#) A2(-) 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 5 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 所有样品各加入 2µl 6×loading buffer，混匀后再上样。
细枪头粘菌：镊子取细枪头,枪头粘1个菌落,然后置入 EP管,用手转动枪头几圈,弃枪头。(在平板上做好标记)
② 循环扩增：按下述程序进行扩增 95℃ 预变性 5 min 94 ℃ 变性 45 sec 50 ℃ 退火 45 sec 30 cycles 72 ℃ 延伸 45 sec 72 ℃ 延伸 5 min
TaqDNA聚合酶 dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）反应缓冲液

简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤

简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物学实验中被广泛应用的技术，它能够在体外扩增特定的DNA片段。

PCR的基本步骤涉及到DNA的分离、引物设计、扩增、检测等多个环节。

本文将简述PCR的基本步骤和内容。

PCR的基本步骤PCR主要包含三个基本步骤：变性、退火和延伸。

下面将详细介绍每个步骤的内容和操作。

变性（Denaturation）变性是PCR的第一个步骤，它的目的是将双链DNA分离成两条单链DNA。

这个过程通常通过加热反应体系到较高的温度（通常是95°C）来实现。

在这个高温下，氢键断裂，双链DNA解偶，形成两条单链DNA。

退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，它涉及引物的结合和弱的碱性条件。

在这个步骤中，温度被降低到适合引物与目标DNA序列结合的温度。

引物是两小片DNA序列，它们分别位于待扩增区域的目标DNA序列的两端。

通过结合到目标序列上，引物提供木核酸链的起始点。

延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，它在合适的温度和时间下进行。

在这个过程中，聚合酶（如Taq聚合酶）通过加入互补的核苷酸，将引物与单链DNA扩增为双链DNA。

聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链，并到达引物的5’端。

一个完整的PCR循环完成后，会产生两条与目标DNA序列相同的DNA片段。

PCR的循环PCR的基本步骤在一个循环中完成一次，但为了扩增特定的DNA片段，需要进行多个PCR循环。

这些循环由PCR仪自动完成。

一般情况下，PCR的循环次数在20-40次之间。

PCR的应用PCR技术被广泛应用于多个领域，包括基因分型、基因突变检测、遗传学研究等。

通过PCR技术，可以在短时间内快速扩增目标DNA片段，为后续实验打下基础。

结论PCR是一种重要而有效的DNA扩增技术。

通过其基本步骤的反复循环，可以在体外快速扩增特定的DNA片段。

在实际应用中，我们可以利用PCR技术来进行遗传学研究、医学诊断以及其他领域的实验。

菌液PCR

菌液PCR的经验由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR 的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen 的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA 3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2. 菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rp m摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3. 菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4. pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5. 模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6. 退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C 均可以P出目的条带7. 循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8 .预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

pcr技术原理实验步骤和应用过程

pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。

它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。

PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。

PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。

具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。

2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。

3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。

4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。

5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。

PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。

通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。

2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。

通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。

这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。

3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。

通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。

这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。

pcr技术及其产物鉴定实验步骤

pcr技术及其产物鉴定实验步骤介绍PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可在实验室中复制并扩增特定的DNA片段。

该技术在基因测序、疾病诊断和遗传学研究等领域具有重要的应用价值。

本文将介绍PCR技术的基本原理以及实验步骤，以及PCR产物的鉴定方法。

PCR技术原理PCR技术基于酶的活性，通过体外复制DNA。

该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，DNA的双链结构被加热分解为两条单链。

在退火步骤中，引物（即DNA复制所需的起始序列）与目标DNA序列的互补部分结合。

在延伸步骤中，DNA聚合酶在退火后重新合成DNA链。

PCR实验步骤以下是PCR实验的一般步骤：1. 样品准备从待检测的样品中提取DNA。

可以使用多种提取方法，如正常提取、血液提取或组织提取方法。

2. PCR试剂准备准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液和PCR酶。

3. PCR反应设置将PCR反应液分装到聚合酶链式反应管中。

4. PCR反应条件设置PCR反应条件，包括温度和时间。

5. PCR循环将PCR反应管放置在热循环仪中进行PCR循环。

PCR循环的次数取决于所需扩增的DNA片段的数量。

6. 电泳分析使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

将PCR产物与DNA大小标准一起加载到琼脂糖凝胶上，然后通过电场使DNA在凝胶中移动，并使用紫外线照射来观察DNA片段的迁移。

PCR产物鉴定方法通过PCR产物鉴定可以确定目标DNA片段是否被扩增成功。

以下是PCR产物鉴定的几种常用方法：1. 凝胶电泳分析将PCR产物与DNA大小标准一起加载到琼脂糖凝胶上，并通过电泳分析来观察DNA片段的迁移和大小。

2. DNA测序通过DNA测序技术来确定PCR产物的序列，从而验证目标DNA片段的扩增情况。

3. 启动子鉴定通过PCR产物的韧带背法或限制酶切等实验方法，来鉴定目标DNA片段是否存在期望的启动子序列。

结论PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，可以高效地扩增特定的DNA片段。

酵母菌落PCR试剂盒使用指南

产品编号
CAT：RY8001
保存条件
-20 ℃保存，有效期1年
产品组分
产品概述
本试剂盒含有绿色染料，可在反应结束后直接进行电泳，能够快速扩增酵母中重组质粒目的基因片段，省时省力。

Yeast lysis buffer用于破坏酵母的细胞壁；2×Yeast PCR mix含PCR buffer，dNTPs，MgCl2，热启动快速Taq酶，客户只需加入引物和模板/酵母菌落即可进行扩增，减少移液操作，提高了稳定性，且2×Yeast PCR mix中含有保护剂，反复冻融后仍可保持稳定性。

PCR产物的3’端带有A，可直接用于TA克隆。

实验流程
1、吸取3-3.5 μl Yeast lysis buffer到PCR管中，用无菌枪头或牙签蘸取适量酵母菌至PCR管中。

2、吸打（搅拌）混匀后，置于98 ℃反应10-20 min。

3、再准备一支无菌PCR管，按下表配制反应体系。

PCR反应体系：
* 步骤2的反应液短暂离心,混匀后吸取1 μl作为模板，为佳
PCR反应条件：
* 该退火温度根据引物的Tm值进行调整，一般设置Tm -5 ℃
案例：
图注：从SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基中挑取酵母菌落直接进行酵母菌落PCR
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。

菌落pcr的原理

菌落pcr的原理
菌落PCR是一种用于从菌落中扩增特定目标DNA片段的方法。

其原理基于PCR（聚合酶链反应）技术，结合了传统菌落的
筛选方法和分子生物学的基因扩增技术。

首先，需要从培养基上选取菌落，通常使用无菌的鉴别针或者微量滴管进行取样。

然后，将选取的菌落样品放入一个反应管中，并加入适当的缓冲液和其他PCR反应体系所需的试剂。

接下来，使用一种适当的方法，如热酸法或碱裂解法，将菌落中的DNA释放出来。

这些方法可以有效地破坏细胞壁和细胞膜，从而使DNA能够在PCR反应中被扩增。

在DNA释放的基础上，添加一对特异性引物（引物是一段DNA序列，可以与目标DNA序列的两端恰好互补配对）到PCR反应体系中。

这两段引物会在特定的温度下与目标DNA
序列的两端互补配对，并起始引物延伸。

在PCR的反应过程中，反应管中的温度会被嵌合，变性和延
伸所需的一系列温度循环控制。

这些循环重复进行，使得每一轮都会使DNA双链被解链，并在延伸的过程中合成新的
DNA链。

这样，目标DNA序列会随着PCR循环的进行不断
被扩增。

最后，通过电泳或其他检测方法，可以将PCR扩增产物进行
分离和检测。

如果目标DNA序列存在于菌落中，则可以在菌
落PCR产物中观察到特定大小的DNA片段。

总的来说，菌落PCR技术利用了PCR的基本原理，通过从菌落中提取DNA，并使用特异性的引物扩增目标DNA片段，从而快速、高效地检测和鉴定菌落中的目标基因。

菌液PCR经验

菌液PCR经验总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物4 d i+ b' D9 _4 _. D6 R5 K如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R9 i' {( P3 O& M2 gpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）- ^5 m5 T8 j" a( t( F挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中* f2 B5 a* q( E$ ~4 p37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上, y9 \& F& Y$ a& P/ N, v. R2 r（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）J提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉,我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度r5.模板的量：1-2ul, ~6 U. i5 _0 @1 z K# ]' w未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）7 v6 O# l" ~; G+ G1 E4 ^7 v2 ^# ^2 b8 m9 T' r( V" l J: c6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成,T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7 @4 D# s. P0 j' a+ l2 u7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P 出来' x& I2 H; W! L6 B* W# A& h, Q0 F8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步a5 w7 C% _. S2 W% M7 s再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇3 b% u& Z7 P: Q$ I- Q4 Q1 y# V补充说明如下：7 v/ [$ Z% S$ X' D V8 `% k7 k鉴于很多同仁提到的假阳性的问题8 D- e' X5 S' E3 J我补充说明一下) M3 C" D; g! G( q- b1 y0 n* c4 W$ ]& j* @1 h# |0 M1.我需要做菌液PCR的目的是为了选取基因重组中的阳性克隆+ w* |. }0 Q" H5 x% {1 Z如果只是鉴定已获取的阳性质粒或是扩增,则不存在假阳性一说i) n2.我后面也补充说明了) R9 B' q3 \. _4 L* o通过调整合适的插入片段和载体的比例，基本上可以使得每个长出的菌落均为阳性菌落# n6 a$ R6 s( s$ G, _7 u后一组我后来通过浓度梯度做出来的图片# ?: p( G0 q5 T! M# w0 O* g插入片段和载体的mol比分别为4:1，7:1，10:1' j1 H3 N- D- w5 R8 b3种比率中7：1的是阳性连接比率最高的6 [4 B0 N% }6 _ S! j8 q0 c: f, [4：1的空载体最多所以，我想强调的是：通过调整合适的插入片段和载体的mol比例是可以完全做到长出的菌落全部为阳性菌落的另外，在挑取菌落的时候也是有讲究的,对于阳性菌落和无插入片段的载体菌落大小上是有一定区别的我在文章后来提到的通过选择具有一定特征的菌落以达到很高的阳性率也是可以做到的就是这个意思G" {我想通过这些手段也完全可以使菌液PCR显得多余所以我在文章的开头也说了,这篇文章应该是适合各位新手开始做重组时候的方法+ \3 |/ B9 O* i最后还有一个因素就是大家做重组的步骤上或许也有一些原因1 y- Y4 v) ?2 M+ w' h8 Z/ h, f7 P! T我用的是Invitrogen的T4 DNA ligase P$ {, n& X T( Q6 t4 T条件：26°C2-4h （我知道最好是16度过夜，只是苦于我们这里的实验室老师不让我们用PCR仪过夜，其他的设备又不能维持稳定的温度，且还和室温有关）转化：取1-2ul转化20ulTop10感受态细胞最后取150ul涂板，37°C过夜! j中间我也冥思苦想，考虑假阳性的源头最后考虑到的唯一的可能就是来自于未能和载体连接上的插入片段+ z7 M( N0 c1 ^我是直接取的连接产物去做转化2 F# s: B2 X1 r- _+ d* V- J（Invitrogen推荐的是将连接产物稀释至少10倍以上之后取2ul转化）: V- l b* S2 o3 d+ _自然这部分未能连接上的片段也被带入到扩增体系中0 A8 R' w7 u8 y) Y7 ~- ]最后这部分微量的插入片段被PCR仪扩增出来。

PCR步骤

HVKP提取DNA模版煮沸法：血琼脂平板培养菌落37℃过夜，小枪头弯曲后刮取菌落到事先加有800ul ddH2O的EP管中，（另放置两份到甘油肉汤中-20℃保存菌落）103℃15min加热后，12000r/min 离心15min 4℃，取上清液400ul（注意枪头不能插入过深避免接触最下沉淀物，只取一次！）为DNA模版（-20℃保存）。

PCR反应体系：12.5ulddH2O，12.5ul MIX（各种酶，dNTP）,1ul 引物R,1ul 引物F上述四种物质混合后批量取25ul 加入离心管中，分别依次加入1.5ul DNA模版。

PCR过程：预变性：95℃3min34*循环反应：变性：95℃30S退火：58℃30S延伸：72℃1min72℃(5 min) 确保充分延伸4℃1h 保存配胶：1g琼脂糖粉末加入100ml 0.5*TBE中，微波炉加热煮沸3次使琼脂糖完全融化，浑荡至溶液澄清后即制成1%琼脂糖溶液，将热溶液冷至55 ℃，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板封边，放置样品梳（梳齿下端离玻璃板0.5 -1.0mm），接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入），室温静置30min后自然凝固呈凝胶状。

待完全凝固后小心取出加样器，在电泳槽中加入适量电泳缓冲液0.5*TBE，使胶板浸没在电泳缓冲液下约1mm 处。

加样：所加样品应有适当浓度与较小体积，用微量注射器缓慢加入样品，取上述PCR产物5ul（或6ul），点样时电源必须处于关闭状态。

电泳：经1%琼脂糖凝胶电泳110 V 30min/120V 25-30min。

（目的基因Bp越长电泳得到目的条带所需时间越长）染色：将电泳后的凝胶放置于EB染液中染色30min后取出。

以DNA 电泳为例常用荧光染料溴化乙锭（EB ）进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA 条带。

EB 能插入DNA 分子中碱基对之间，使脑部（超螺旋DNA 与EB 结合能力小于双链闭环，而双链闭环的DNA 与EB 结合能力小于线状双链DNA ）。

(整理)酵母菌落PCR

酵母菌落PCR方法酵母菌落PCR方法，酵母菌落PCR方法，涉及提取DNA方法、PCR方法问：很郁闷，最近在做电转毕赤酵母，但是转化完了没有合适的筛选方法，如果提基组的话费时费钱，而且由我这个电转的几率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR 方法筛选，但酵母菌破壁很困难，如果处理不好的话基组释放不出来，就没有阳性结果了。

查了一些资料说用反复冻融法，是不是直接挑单菌落就行了呢？还有说用蜗牛酶帮助消化的，这个我倒不是很清楚，所以请各位大虾们帮帮忙，在实在是被这个伤透脑筋了！求助十万火急！！！！！！！答：蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定酵母DNA的提取1、x新鲜的菌中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。

2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul3、加入25ul，10%SDS。

65度，30min水浴。

4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不振荡，直接离心）6、12000rmp，15min，弃上清。

7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min8、将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min9、加入等积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶50ulbufferIII中10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法酵母菌落PCR1、酵母质粒和基组DNAPCR模版的备取对数生长期酵母菌株 1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存－20度取1ul用PCR2、从板上调取长势良好的菌落少许，悬浮含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min3、利用微波炉快速备酵母治理以及菌落取直大3mm的酵母干菌落，至EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR真菌DNA的提取方法改良1、酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌2、取少许新鲜的菌，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。

实验一基因组DNA的提取

实验十菌落PCR筛选阳性重组子【实验目的】学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法【实验原理】细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。

在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。

【仪器、材料与试剂】1 仪器生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统2 材料含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer 1）和引物2（primer 2），PCR管，移液器枪头，ddH2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。

3 试剂PCR试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶；primer 1和primer 2：均配成10μmol的使用液；DNA Marker：根据PCR产物大小确定。

【实验步骤】1 配制25μL的PCR反应体系10×buffer 2.5 μLMgCL2或MgSO4 1.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加）dNTPs（2µmol） 2.5μLprimer 1 (10µmol ) 1μLprimer 2 (10µmol ) 1μLTaq 酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1UddH2O 补至25μL最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。

2 PCR程序配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。

然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。

通常设计的反应条件如下：94℃预变性3～5min；94℃变性30sec～1min50～60℃退火1min 30～35个循环72℃延伸2min72℃最终延伸8～10min设定好程序后，即可开始运行程序，进行PCR。

3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六PCR完成后，取5～8μL PCR产物与适宜的上样缓冲液（loading buffer ）混匀后，加样电泳。

分子生物学实验PCR扩增目的基因

分子生物学实验 PCR扩增目的基因
实验目的
(1)PCR扩增目的基因红细胞生成因子nap基因部分片段；
(2)掌握PCR扩增原理； (3)学习并熟悉PCR操作
实验原理
(1)PCR反应原理
温度（℃）
94
循环1
94℃变性（1min）
72
60
60 ℃退火
（1min）
循环2
循环3
时间（min）
三、仪器和试剂
1．仪器：、1ml、5ml移液管；试管14个；分光光度计等。
2．试剂：（1）0.9% NaCl溶液；（2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成的原液。（3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
(2)可用更剧烈的方法来分离小质粒
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒 DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
步骤
二、实验原理
根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在
0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在
595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的蛋白质常用分析方法。

菌落PCR法

菌落PCR法
利用PCR分析酵母菌落
1.在一个无菌的0.5ml微量离心管里，依次再加入下列物质：
10×菌落PCR缓冲液2μl
25mmol/L MgCl2 1.2μl
10mmol/L dNTPs 0.4μl
寡核苷酸引物每个引物浓度为10 pmol
Taq聚合酶5单位（0.2μl）
H2O加至总体系为20μl
2.用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落（0.1-0.25μl），加入反应体
系。

取酵母菌落时切不可过多。

因为细胞壁的成分可抑制PCR反应。

3.将PCR管放进PCR仪内。

进行PCR反应。

4.用琼脂凝胶电泳分析PCR产物。

如果目的序列的扩增条带微弱或者杂乱，将链延伸温度比按AT含量丰富的那条寡核苷酸引物的T m计算值降低2~3℃，重新PCR。

如果PCR结果仍然不十分满意，可在PCR前用酶解酶100T除去细胞壁，使酵母细胞成为原生质体，此步骤仅需1h，通常可以解决问题。

另一种方法是，将待测菌落在10mlYPD培养基中培养，制备少量的酵母DNA用于扩增。

实验六菌落的PCR鉴定

实验六菌落的PCR鉴定
主讲人：邢丹丹
一、实验目的：通过本实验学习菌落PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理：重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。
为什么蓝白斑筛选会出现假阳性：

有可能是载体自连的假阳性。
有时即使插入片段也会出现篮斑。只要编码框没被破坏。发生这种情况主要是目的片段插入后不能破坏编码β半乳糖苷酶的读码框，使其依然能和宿主细胞的C端形成α互补。

有可能连接体系有外源性核酸酶污染，使T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。
Total 20
Mix（18 μL ）
将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15sec使反应成分集于管底。
六、PCR反应热循环程序设置
① 94 ℃ 预变性 5 min;
② 94 ℃ 变性 30 sec;
③ 64 ℃ 退火 30 sec; ④ 72 ℃ 延伸 1 min; 30 cycles
4、原料：dNTP Mixture dATP 、dGTP、dCTP、dTTP 等摩尔的混合物。 5、反应缓冲液 10×PCR Buffer 的组成。
五、实验步骤
用200 μL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 μL无菌水中，吹打混匀，切记勿离心，从中取2μL菌液作为菌落PCR模板。
在200 μL PCR 管内配制20 μL反应体系：反应物体积/μL 模板DNA 2.0 灭菌蒸馏水（ddH2O) 10.3 10×PCR 缓冲液 2.0 dNTP （2.5mM） 1.6 引物1 （2μM） 2.0 引物2 （2μM） 2.0 rTaq 酶（1.0单位） 0.1

酵母菌落PCR

2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul3、加入25ul，10%SDS。

65度，30min水浴。

菌液PCR

此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互学习下，见笑）由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR 其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。