分子生物学综合实验报告

分子生物学综合试验报告综合实验Ⅰ.Southern杂交（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、地高辛标记的Southern杂交）一.实验目的1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。

DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。

最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。

对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。

一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。

通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。

以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。

一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。

免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。

三．实验准备1.实验材料：含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基2.实验试剂：Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。

20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1MTris-HCl， M NaCl. pH=，封闭液：1%Blocking Reagent/ Tris-HCl，NaCl，显色缓冲液： Tris-HCl， NaCl，pH=， TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH ，2%，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的%），溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，TE缓冲液，无水乙醇和70%乙醇。

3.实验仪器：微量移液器，离心管，DNA吸附柱，DNA收集管，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，恒温水浴箱，PCR仪，培养皿，超净工作台，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

四．试验方法1.质粒的提取：①培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。

②提取步骤●取 mL 过夜培养的菌液，加入离心管中，6000rpm离心1min，尽量吸除上清，重复两次●向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

●向离心管中加入250μL 溶液P2，温和翻转多次使菌体充分裂解。

●向离心管中加入350μL 溶液P3，温和翻转多次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm离心10min。

●将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3 中，注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm离心1Min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

●向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

●重复操作步骤6。

●将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm离心2min。

●将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL 洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm离心1min 将质粒溶液收集到离心管中。

③琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA2.聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA：●按下表加入试剂，并小心混匀。

模板为实验一中提取的质粒DNA●设置PCR 程序●运行PCR 程序●反应结束后，取20μl PCR 产物进行% 琼脂糖电泳分析3.地高辛标记的Southern 杂交：●将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

● 加入20ml Standard buffer ，65℃预杂交4-20小时。

● 将制备的DNA 探针沸水浴加热10min ，迅速置冰浴5min 。

全部加入杂交管。

●使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。

●杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。

这样至少可以保存一年。

再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃ 10分钟以变性探针。

● 取出杂交膜，用Wash Solution I 洗5分钟×3次。

● 保温冲洗：用 Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟×2次。

94180s 9445s 325545s 7245s 72600scycles ⎧⎪⎪⎪⎨⎪⎪⎪⎩℃℃℃℃℃NBT 显色检测法：●经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。

●用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。

●用封闭液1：2500—5000稀释 Anti-DIG-AP，例如2μl Anti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。

稀释液4℃可稳定12小时左右。

●加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。

●用冲洗液洗15分钟×3次，每次100ml。

●按1：50配制底物显色液：例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

●显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。

●加100ml底物显色液（100 cm2）。

将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。

显色过程中可以观察。

一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。

应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

●当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。

结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。

还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。

但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

五.实验结果及分析图1中，共有16个条带，说明大家都提取成功了，只是右边几个亮度比其他的低，说明提取的DNA含量低一些。

图中有一些亮点，应该是胶上有杂质。

GFP质粒提取为8个人一组，所以上图共有四个条带，说明提取成功，而且亮度高，说明含量高。

上面图3中的第一张是班里的14个人的，后两张是另外14个人的，只是曝光时间不同。

三张图中的所有条带整齐而且亮度高，表明大家的P38质粒的PCR扩增很成功。

在酶切点样中，右边第一个为Marker,第二个为质粒，第三个为酶切，后面几个为质粒的PCR。

图中条带较整齐，有些亮度不够，可能是含量较低。

酶切条带与Marker的条带基本一致，但亮度稍低，含量较低，但总体来说酶切还是不错的。

显色后，可以看到有两个PCR位点和酶切位点，一个质粒，说明杂交结果很好。

综合实验二.RT-PCR扩增目的基因cDNA（植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析；植物RNA提取、定量及电泳分析；RT-PCR扩增目的基因cDNA）一．实验目的1.掌握植物基因组DNA提取方法及注意事项，大分子量DNA分子的酶切分析。

2.掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

3.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二．实验原理CTAB可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。

通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液。

取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。

提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。

逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。

这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。