Boc法_固相多肽合成

Boc法固相多肽合成
SPPS是以在不溶性聚合物支持体上按序添加ɑ-氨基和侧链保护的氨基酸为基础的。

而Boc法则是以易酸解的Boc基团作为N-ɑ-保护基团。

切除此保护基团后，下一个被保护氨基酸通过使用连接试剂或预先激活的受保护氨基酸衍生物添加上去。

多肽链的C端通过一连接体与树脂相连，其依赖于不同的连接剂的使用而被切割成为多肽酸或多肽酰胺。

通常选择性使用氨基酸侧链保护基团而使得切除树脂的同时切除这些侧链保护基团。

Boc基团用TFA切除。

肽基树脂的最后切除和侧链保护基团的切除需要使用强酸，在Boc化学中使用HF酸或TFMSA。

DCM和DMF是树脂脱保护耦联和洗涤的首选溶剂。

Boc法其缺点是反复使用TFA酸解脱保护会导致多肽复合物中易酸解的保护基团产生一些副反应，而且Boc基团的切割和脱保护要求使用危险的HF和昂贵的实验仪器，而这些都是研究者不愿使用的。

一般的Boc法固相合成方式描述如下。

一、树脂合成：
1、Peptide acid Merrifield Resin and PAM Resin
2、Peptide carboxamide MBHA Resin
二、肽链合成：
氨基酸的耦联同Fmoc SPPS 类似，不同的是氨基酸N末端保护基Boc的脱除。

N-端Boc基团的切除：
在HF切割以前须将 N-端Boc保护基团用TFA除去。

因为它不仅会阻碍后面的HF切割除去t-bu基团，而且还会通过离子交换切除所有肽链中Boc基团保护的氨基酸。

手工切割N-端Boc基团方法是用TFA/DCM比为1：1的溶液在室温条件下洗涤反应15分钟。

三、切割
无水HF是多肽中Boc树脂切割的常用试剂。

在大多数Boc树脂多肽的所有的切割程序中HF是最通用和危害最小的。

其主要缺点就是它的高毒性和反应活性，因此必须使用防HF头罩及切割仪器。

其它的强酸如TFMSA和TMSOTF也能用
来替换HF作为PAM和MBHA树脂的切割剂。

虽然比HF活性小，但是在使用它们的时候同样需加以注意。

此处仅介绍HF切割法。

3.1 切割前的树脂准备
多肽树脂切割前的准备对防止副反应的发生及切割和脱保护的完全起着相当重要的作用。

切割试剂和脱保护方法的选择不仅仅与所用树脂有关，而且同肽链的氨基酸顺序及其侧链保护基团的选择有关。

在合成前确定所用树脂和侧链保护基团适合于所用的切割方法。

所有树脂在切割前必须完全的洗净和干燥。

特殊情况处理:
1) His的Dnp保护基团的切割
如果肽链上含有His(Dnp)，那么在对N-端Boc基团的切割前必须将Dnp除去。

Dnp保护基团的切除及一些His衍生物的细节处理:
1. 用最小体积的DMF溶胀树脂。

2. 用20mol的苯硫酚处理1-2小时。

3. 将树脂转移到黏结玻璃漏斗中，在用HF液体或TFMSA处理前以DMF，甲醇和冷乙醚频繁冲洗。

2) 含Trp的多肽树脂的脱甲酰基作用
甲酰基对酸切割试剂稳定，可以用标准HF法提前切除。

虽然Trp中未加保护的吲哚环会由t-bu正碳离子引起烷基化作用而对HF切割产生影响，但是一些净化剂如吲哚已经被成功用来保护含Trp的多肽以免烷基化。

然而，吲哚可以在酸催化条件下缓慢与Trp二聚形成不可逆的吲哚环。

另一方面，虽然不大可取，还可以通过用高HF水溶液切割例如羟胺在pH9.0条件下切割两小时。

哌啶对含Trp(For)多肽树脂的脱甲酰基作用:
1. 以体积比为1：10哌啶/DMF液放入圆底烧瓶中，并在冰浴中冷却。

2. 加入多肽树脂（1g/10ml），在00C下搅拌反应2小时。

3. 用DMF（5倍体积）洗两次，DCM两次，MeOH两次。

4. 用HF切割前高真空干燥上述所得树脂至少4小时。

3.2 HF 切割
警告：无水HF是一种具强腐蚀性和挥发性的有毒液体。

所有使用HF的程序
中都要求在排风罩中使用耐HF仪器。

不要使用玻璃仪器，因为HF会使其快速溶解并释放热量。

当使用HF时，必须佩戴眼罩，面具，橡胶挡板及手套。

吸进HF 气体会导致死亡。

标准HF切割
HF切割一般是在0-50C下反应30-60分钟。

肽链如包含Arg（Tos）可能就需要更长的时间。

如果肽链中含有一些具复杂残基的氨基酸如Trp,Met,Asp,Glu 和Tyr等会给切割带来麻烦。

对于这些基团的一些处理方法可见于section1,page B1。

在切割和脱保护中时间和温度对尽可能减少副反应的发生起着相当重要的作用。

含有Asp/Glu(OBzl)或Asp/Glu(OcHx)的肽链切割温度必须小于50C以防止个别形成门冬酰胺。

降低温度会影响到侧链上保护基团的切割效率。

含有Arg(Tos),Cys(pMeBzl)和Lys(2-Cl-Z)的多肽树脂在小于50C的切割反应很慢而且并不可取。

含有Arg(Tos)的树脂要求在50C下切割2小时以上。

当含有His(Dnp)或Trp(For)时，得先做预切割试验。

净化剂在减少副反应的发生上起着重要作用。

在HF切割苯甲醚是一种常用的净化剂用来防止由t-bu和苄基阳离子引起的Trp的烷基化作用。

在DMS和p-甲苯硫酚的连接中，苯甲醚可以防止Met和Cys的烷基化作用。

如果肽链中含有Trp则应避免使用苯硫基甲烷，因为其阳离子的内收会使Trp吲哚环上的N烷基化。

标准HF切割法（0.2mmol）
1. 将多肽树脂，聚四氟乙烯管和净化剂混合物加入反应容器中。

含Cys的多肽用HF/苯甲醚/DMS/p-苯甲硫酚（10：1：1：0.2），而不含Cys的用HF/DMS/苯甲醚（10：1：1）。

2. 将盖子旋紧，切割前在冰的纯甲醇中冷却至少5分钟。

3. 在参照生产商的说明下蒸馏10ml的HF到瓶中。

因为含Arg(Tos)的多肽切割会持续2小时以上。

4. 反应最后，通过氮气流蒸发HF和DMS。

5. 用TFA从树脂上吸取出切除下的多肽。

6. 负压下过滤移走树脂，用TFA洗树脂两次。

过滤筛选，加入8-10倍的冷
乙醚。

有时需要蒸发大多数TFA以得到粗品的沉淀物。

7. 切割后期处理：肽的分离和处理可以用醚沉淀或离心的方法得到，对于水溶性肽，方法3-6可以用。

1）．沉淀，在真空下在Hirsch漏斗中用硬滤纸过滤沉淀的肽。

用冷醚冲洗沉淀物，在合适的缓冲溶液中溶解太。

然后冻干
2）．离心，加入少量体积的叔丁甲醚在残留物中做底，研磨，直到得到悬浮物，那悬浮物转移到一个干净的离心管中，密闭离心，自动离心机在这过程中是必须的，将醚从管中小心的倒出，用醚重复洗涤，溶解残留物在合适的缓冲溶液里，后冻干
3）．水溶性肽，沉淀后，加水到残留物中，然后把混合物转移到分离漏斗中，少量乙醇可能会用于助容。

4）．充分摇晃堵塞的漏斗，分散堵塞物，静止让两层分离，分离下层液（水）5）．加多量水到漏斗中，重复步骤4三次，移去上层液，然后放置于干净的烧瓶中，将混合液移到分离漏斗中
6）．加少量的新配二乙基醚，重复步骤4)二到三次，每次都把醚层移去，把水层放到分离漏斗中，收集水层到干净的烧瓶，冻干。

在以上描写的方法中，如果TFA是先用旋转蒸发移去的，肽收率经常可以增加，优于醚沉淀步骤，在大多数情况下，加醚后，肽会粘到反应瓶上，这时需要通过重复的醚洗涤，而净化剂的加入可以较为有效的阻止这种情况的发生。

注意，在所有上面的方法中，二甲基醚可以取代叔丁甲醚。

附：Boc法合成用氨基酸（HF切割）
Arg(Mts) Arg(NO2) Arg(Tos) Asp(OBzl)
Asp(OcHx) Cys(pMeBzl) Cys(Acm) Cys(pMeOBzl) Glu(OBzl) Glu(OcHx) His(Bom) His(Dnp)
His(Tos) His(Z) Lys(2-Cl-Z) Ser(Bzl)
Thr(Bzl) Trp(For) Tyr(2-Br-Z)。