制备感受态细胞 氯化钙法
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
§1氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA 片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖,重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA 分子转化率高1000倍。
除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。
三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。
4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。
4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理1. 了解感受态细胞1.1 什么是感受态细胞？好啦，首先咱们得搞清楚什么叫“感受态细胞”。
简单来说，这种细胞就像是打了鸡血的年轻人，随时准备接受外界的挑战。
它们能吸收外来的DNA，就像海绵吸水一样，真是个“好学生”啊！这在基因工程和克隆技术中可是个大角色。
1.2 为啥要制备感受态细胞？那么，咱们为什么要制造这些细胞呢？想想吧，想把外来的基因塞到细胞里，就得让这些细胞有能力“接受”这些信息。
而氯化钙法就是个好帮手，让细胞变得更“友好”。
一旦细胞“接受”了外来的DNA，后面就能大展拳脚，生产咱们需要的各种蛋白质，真是太棒了！2. 氯化钙法的原理2.1 氯化钙的角色接下来，咱们来聊聊氯化钙的神奇之处。
它就像个“催化剂”，帮助细胞的膜变得更加通透。
要知道，细胞膜可不是随便就能让东西进来的，这可得讲究技巧。
氯化钙通过改变细胞膜的电位，让细胞“开门迎客”，让外来的DNA能顺利进来。
2.2 制备过程制备感受态细胞的过程其实也蛮有趣的，像是做一顿大餐，得准备好所有的食材。
首先，咱们需要培养一些细胞，让它们长得壮壮的。
接着，拿氯化钙溶液把这些细胞“泡”一下，时间可不能太长，否则细胞就变得“过于紧张”，容易出事。
然后，把细胞和DNA混在一起，稍微摇一摇，让它们互相“认识”。
最后，再给它们一个“热身”，放到37度的环境中，让它们慢慢适应，这样就能提高DNA的吸收率了。
3. 注意事项3.1 细胞的选择不过，制造感受态细胞并不是一帆风顺的，选择合适的细胞可是个技术活。
不同的细胞对氯化钙的反应可不一样，有些可能会对你说“谢谢，不用了”，而有些则会欢呼雀跃，接受外来的DNA。
所以，选择细胞时可得好好研究，别瞎撞。
3.2 实验环境此外，实验环境也很重要。
实验室就像是一个小宇宙，必须保持整洁和稳定。
温度、湿度、气体成分，这些都得像对待女朋友一样小心翼翼，稍有不慎，细胞就可能“罢工”。
所以，千万别小看这些细节，搞不好就得重头再来，真是得不偿失。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
感受态细胞的制备(氯化钙法)
感受态细胞的制备（氯化钙法）
（1）将-80℃保存的甘油管E. coli DH5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒放于37℃恒温培养箱中，过夜培养12-16 h；
（2）从平板上挑取单菌落接种于5 ml液体LB试管培养基中，37℃振荡培养过夜；
（3）按1%-5%的比例将种子菌液接种于100 ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6-0.9（一般按照2%的接种量培养3 h即可）后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；
（4）将菌液转入50 ml离心管中，在冰上放置10 min，于4℃低温离心机以6000 rpm/min 的速度离心10 min，收集菌体；
（5）弃上清，加入1/10体积（10 ml）预冷的感受态制备液buffer 1，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中切忌用力过大以免破坏菌体细胞，冰浴10 min；
（6）冰浴后再次于4℃低温离心机中以6000 rpm/min离心10 min，弃上清后在冰上加入2 ml 预冷的感受态制备液buffer 2重悬菌体，最后将细胞按100 ul/cell分装，取100 μl制备进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置于-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
cacl2制备感受态细胞的原理
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用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
CaCl2法制备感受态细胞知识讲解
C a C l2法制备感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
CaCl2法制备感受态细胞
Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞
1、挑取37℃培养16—20h的单菌落（直径2—3mm）于含有100mlLB或SOB 的500或1000ml的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2—0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD值为0.2—0.4时，约含109个菌/ml；
2、转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。
将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；
3、将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；
4、弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；
5、用30ml冰冷MgCl
2—CaCl
2
溶液（80mMMgCl
2
和20mMCaCl
2
）漩涡振荡重悬
菌体沉淀，置于冰上10min；
6、将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；
7、弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；
8、用2ml冰冷0.1MCaCl
2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl
2
/50ml原初培养物）漩涡
振荡重悬菌体沉淀；
9、放于4℃冰箱14-20h。
获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%，分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理【化学魔法，感受态细胞的秘密】哎哟喂，朋友们，咱们今天要聊的可是个高大上的科学话题——氯化钙法制备感受态细胞的原理。
这个听起来是不是有点像变魔术？没错，它就像是把普通的水变成了神奇的药水，让我们能够在实验室里轻松地培养出那种超级无敌的感受态细胞！咱们得知道什么是感受态细胞。
简单来说，就是那些经过特殊处理，能够接受外源DNA并稳定表达的细胞。
这些细胞就像是一个待命的“小精灵”，一旦有新的“任务”下达，它们就能立刻变身为执行者。
而氯化钙法，就是我们用来驯服这些小精灵的神奇魔法棒。
那么，氯化钙法是怎么做到的呢？其实，这全赖于氯化钙那神奇的“魔力”。
想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，那些原本呆若木鸡的细胞们就变得活跃起来，仿佛被施了魔法一样。
这个过程就像是在给细胞们穿上了一件隐形的斗篷，让他们能够在各种环境中自由穿梭，不受外界干扰。
接下来，咱们来聊聊氯化钙法的具体操作步骤。
你得准备好一些氯化钙溶液和感受态细胞。
然后，按照一定的比例将氯化钙溶液加入到感受态细胞的培养基中。
这时候，你只需要静静地等待，看着那些细胞们如何在氯化钙的“魔法”下翩翩起舞。
大约过了几分钟后，你就会发现，那些原本僵硬的细胞们已经变得活力四射，仿佛被注入了一股新生的力量。
当然啦，氯化钙法虽然神奇，但也不是万能的。
有时候，我们可能需要根据具体情况对氯化钙法进行调整。
比如，如果你需要培养的是一些对氯化钙敏感的细胞，那么你就得小心一些，避免过度使用氯化钙。
也要注意观察细胞的变化情况，以便及时调整实验条件。
我想说的是，氯化钙法制备感受态细胞的原理就像是一场精彩的魔术表演。
它不仅让我们能够在实验室里轻松地培养出感受态细胞，还让我们对生物学领域有了更深的了解和认识。
所以，下次当你看到有人用氯化钙法制备感受态细胞时，不妨学着用一颗好奇的心去探索这个神奇的世界吧！。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理揭秘！氯化钙法如何变身“魔法棒”，让感受态细胞翩翩起舞嘿，朋友们，咱们今天来聊聊那个让人既激动又神秘的化学小把戏——氯化钙法制备感受态细胞。
这个听起来有点高科技的玩意儿，其实就藏在我们实验室里那些小小的试剂瓶和试管里，就像是魔法师手里的魔杖一样，轻轻一挥，就能把感受态细胞变成超级英雄！你得知道什么是感受态细胞。
这可是个高科技生物工程中的宝贝疙瘩，它就像是一个经过特殊训练、随时准备接受新挑战的小战士。
科学家们用它来接收外源DNA，就像超人接住飞来的球一样，神奇极了！那么，氯化钙法是怎么做到的呢？简单来说，就是利用氯化钙这种化学物质的特性。
想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，魔杖尖端冒出了一束神奇的光，那光一接触到细胞，细胞就像被施了魔法一样，开始变得活泼起来。
这就是氯化钙法的魅力所在——它能让细胞“活”起来，准备好迎接新的挑战。
不过，别以为这个过程就这么轻松哦。
科学家们可是花了不少心思和功夫，才让这根魔杖变得如此强大。
他们先是小心翼翼地调配出一种特殊的溶液，然后轻轻地将细胞放入其中。
这个过程就像是在给细胞做一场“SPA”，让它在舒适的环境中彻底放松。
接下来，科学家们会耐心等待，就像看魔术表演一样，期待着那个神奇的时刻。
当看到细胞开始活跃起来，发出微微的荧光时，他们就知道成功了！那一刻，整个实验室都仿佛被喜悦和成就感充满。
当然啦，这个过程虽然看起来简单，但背后可是隐藏着许多科学原理和技巧。
比如，如何控制氯化钙溶液的浓度、如何避免污染、如何确保整个过程的无菌等等。
这些都是科学家们需要仔细研究和掌握的知识。
我想说的是，虽然氯化钙法制备感受态细胞听起来有点神秘兮兮的，但它其实并不是遥不可及的魔法。
只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能像变魔术一样，轻松地将感受态细胞变成超级英雄！所以啊，下次当你看到实验室里的那些小小试剂瓶和试管时，不妨想想它们背后的科学原理和故事。
说不定你会发现，那些看似平凡的试剂瓶里，藏着多少令人惊叹的科学奥秘呢！。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
1.CaCl2法制备感受态细胞(分子克隆)
2007-4-19 健康科学研究所 B细胞与自身抗体研究组 刘占杰CaCl2法制备感受态细胞1、划线（无选择性LB-Agar平板），37℃培养16-20h；2、挑单菌落到2ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌过夜；；3、取1ml过夜菌液到100ml LB培养液中，37℃,300rpm摇菌约3hr，检测OD600nm about 0.44、将菌液转移到50ml BD管中，冰上放置10min；5、4℃，4000rpm，10min，倒出培养液，倒置1min；6、用0.1M CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2,20mmol/l CaCl2）溶液30ml重悬细胞沉淀,冰上30min；7、4℃，4000rpm，5min，到出培养液，倒置1min；8、用2ml预冷0.1M CaCl2-15％甘油重悬细胞沉淀，将其200μl／管分装到灭菌EP管中，冻存于-80℃。
附：0.1mol/l CaCl2： 100ml(1.1g 无水CaCl2＋100mlddH2O)高压除菌；0.1mol/l CaCl2-MgCl2: 150ml(2.439g MgCl2·6H2O, 0.333g 无水CaCl2＋150mlddH2O) 高压除菌；转 化1、-80℃ 取出感受态细胞，冰上融化，加入1μl（50ng）待转化质粒；2、冰上，30min（间隔震荡）；→42℃，90s（勿震荡）；→室温2min3、加入SOC或LB培养基800μl，37℃,50rpm(温柔摇菌)，50min；4、取200μl菌液涂板至液体完全被吸收，倒置平皿，37℃培养14-18h，观察菌落；质粒小抽(Beyotime)1、挑单菌落到3ml 选择性LB培养液中，37℃，225rpm，14-18h；2、收菌液到1.5ml EP管中，离心(RT 5000rpm 3min),弃上清，倒置于吸水纸上，使液体流尽；（重复一次，每管收集3ml菌液）3、用250ul溶液I预冷（保证P1已加RNase），Vortex重悬细胞；4、加溶液II 250ul，颠倒混匀4-6次，室温3min；5、加入350ul溶液Ⅲ，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生;6、最高速度离心(RT 14000rpm 10min)7、上清吸入到质粒纯化柱内,最高速离心60秒，倒弃收集管内液体；在质粒纯化柱内加入750ul溶液IV，最高速离心60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体；再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发;8、将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入50ul溶液V至管内柱面上(中央)，放置1min; 最高速离心1min，所得液体即为高纯度质粒。
感受态细胞的制备
CaCl2法Ecoli DH5α感受态细胞的制备及转化试剂：LB液体培养基 LB/Amp(100ug/ml) 固体培养皿灭菌0.1mol/l 氯化钙，去离子水，灭菌Ep管，灭菌0.1MCacl2/15%甘油。
步骤：1.取DH5α菌划线，过夜培养。
(划线方法：用100μL枪头在菌液中蘸一下，在平板上划S 形，第二次从第一次一个角开始划，分一下，第三次从第二次划线一个角分一下，逐渐降低菌液浓度)。
2.用灭菌枪头挑圆形菌落于LB液体培养基中（试管中5ml），37℃，200rpm，振荡培养12h左右，直至对数生长期。
（小摇）3.将菌种接种在锥形瓶LB液体培养基中（1ml/100ml），37度200r/min,振荡培养2-3h,至OD600=0.4左右。
（可透过锥形瓶中菌液看报纸上的字，模糊可见即可）。
（大摇）4A. 分装到2个50ml离心管中，4℃，3000g，离心10min（离心前，离心机4℃预冷），弃上清。
5A. 加10ml 凉的0.1MCacl2于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀10min。
6A. 4℃，3000g，离心10min,弃上清（从离心机取出时离心管尽量不要摇动）。
7A. 加10ml 凉的0.1MCacl2于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀30min。
8A. 4℃，3000g，离心10min,弃上清。
9A.加入2ml（2ml/50ml初始菌液量）0.1MCacl2/15%甘油于50ml离心管中，轻轻摇匀。
10A. 分装，在每个灭过菌的Ep管中装50μL～200μL，-80℃保存。
4B. 在Ep管中加入1.5ml菌液（2管）冰上10分钟，0～4度4000r/min ,2min弃上清。
5B.加入0.1mol/l氯化钙0.6ml，缓和悬菌，冰上10 分钟，4000r/min 10min,弃上清。
6B. 加入冰氯化钙0.2ml缓和悬菌，分四管，冰上待用（-20度保存）。
转化：1. 具有抗生素抗性的质粒0.5～2μL放入100μL感受态细胞中，冰上30min.2. 42℃热激90s，不要摇动管，立即放在冰上，冰上1～2分钟。
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备感受态细胞下面的方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。
该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且快速，重复性更好。
该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。
为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。
在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各浓度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。
２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。
切记：下述所有步骤均需无菌操作。
３）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
４）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。
制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。
对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
氯化钙法制备感受态
氯化钙法制备感受态一、我制氯化钙法感受态的步骤：二、1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm过夜培养；三、2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm培养2.5 h（OD600nm介于0.4-0.5）；四、3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；五、4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰浴30 min，4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；六、5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，滴加2滴（约100 μl）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。
七、八、需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。
氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。
九、另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受态，不贵。
十、十一、热激法转化大肠杆菌十二、1) 将质粒5 μl （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻柔旋转EP管以混合，置冰浴30 min；十三、2) 随后静置于42 ℃水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；十四、3) 加入895 μl（凑个1ml的总体积，其实多点少点没啥的）LB液体培养基，37 ℃水浴45 min（摇床也行，但是转速要在50rpm 内，太快了容易让质粒丢失）；十五、4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；十六、6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min，倾倒上清，以残留的培养基（~200 μl）混悬细菌，滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；十七、7) 待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大小。
感受态细胞的制备(氯化钙法)
感受态细胞的制备（氯化钙法）
（1）将-80℃保存的甘油管E. coli DH5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒放于37℃恒温培养箱中，过夜培养12-16 h；
（2）从平板上挑取单菌落接种于5 ml液体LB试管培养基中，37℃振荡培养过夜；
（3）按1%-5%的比例将种子菌液接种于100 ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6-0.9（一般按照2%的接种量培养3 h 即可）后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；
（4）将菌液转入50 ml离心管中，在冰上放置10 min，于4℃低温离心机以6000 rpm/min的速度离心10 min，收集菌体；
（5）弃上清，加入1/10体积（10 ml）预冷的感受态制备液buffer 1，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中切忌用力过大以免破坏菌体细胞，冰浴10 min；
（6）冰浴后再次于4℃低温离心机中以6000 rpm/min离心10 min，弃上清后在冰上加入2 ml预冷的感受态制备液buffer 2重悬菌体，最后将细胞按100 ul/cell分装，取100 μl制备进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置于-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。
三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。
氯化钙制备感受态细胞
精品 Word 可修改 欢迎下载 氯化钙法（兴湘）制备感受态细胞什么是感受态细胞？感受态细胞（competent cell ）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态。
氯化钙法（兴湘）制备感受态细胞的原理？细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。
钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。
在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA 进入。
影响感受态细胞制备的因素有哪些？1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期 的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 ×107/ml ）。
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行。
3．经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）。
4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）。
5．所使用的器皿必须干净。
迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA 。
7．一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比感受态细胞制备中，加了两次氯化钙，它们的作用分别是什么？除了增加细胞通透性之外，第一次还有洗净之前一步残留的LB 液体的作用。
精品 Word 可修改 欢迎下载1、最困难的事就是认识自己。
21.5.175.17.202111:1511:15:16May-2111:152、自知之明是最难得的知识。
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氯化钙法（Calcium Chloride）
本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106 到2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA
材料（MA TERIALS）
缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）
（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)
冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)
培养基（Media）
用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture）
LB agar plates containing appropriate antibiotic
核酸（Nucleic Acids）
质粒DNA （Plasmid DNA）
或经过重组的质粒（recombinant plasmid）
方法
1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。
把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。
2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。
3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液，并轻微打匀。
6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。
7. 弃MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。
8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
冰浴放置若干小时为最好。
9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。
10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。
向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。
细心混匀管中成份。
于冰浴放置30到40分钟。
11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。
（此时不能摇动转化管）
12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。
13. 向每只试管中加入500微升LB肉汤。
37°C放置45到90分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。
14. 转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。
15. 室温放置平板直到其上液体被吸收。
16. 于37°C倒置平板培养。
转化克隆应该于12-16 小时区间出现。