第10章_高效液相色谱分离检测技术

影响溶质保留（时间长短）的四大主要因素
（1）溶质分子中非极性部分的总表面积
溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈
弱，疏水性越强，保留值越大。
（2）键合相上的烷基总面积
烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长， 烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。
30～40μ m的玻璃微球，表面附着 一层厚度为1 ～ 2μ m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底。
4.4.1 液谱分离系统 液-固色谱法（LSC） 固定相状态分 液-液色谱法（LLC） 吸附色谱法 HPLC
分配色谱法
离子交换色谱法 分离机制分 分子排阻色谱法 化学键合相色谱法 亲合色谱法
离子色谱法
第2节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪结构及流程
一、输液系统 恒压泵(淘汰)
1．高压输液泵
恒流泵
单柱塞往复泵 双柱塞往复泵(串或并联）
单柱塞往复泵结构示意图
内梯度----高压泵将溶剂按程序压入混合室， 2．梯度洗脱装置
混合后再注入色谱柱
外梯度---多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱
二 元 内 梯 度 洗 脱 装 置 示 意 图
一、化学键合相色谱法 化学键合相（chemically bonded phase）将固定液（含不 同官能团的有机分子）利用化学反应键合到载体表面上，使 其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相 载体-----硅胶 键合反应---硅烷化反应、硅酸酯化反应 1．键合相类型 类型 非极性固定相 (ODS）
在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂 NaOH及被洗脱的组分NaX，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高 本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率 很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。
2．固定相与流动相 基质 ---合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 （1）固定相 类型 离子交换剂 ----键合的离子交换基团 符号 官能团
二、离子色谱法 1.离子色谱法（IC） 离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法
2．分离原理[抑制型（双柱型)] 分离柱 交换反应：R+-OH- + NaX → R+-X-+ NaOH
洗脱反应：R+-X- + NaOH → R+-OH-+ NaX 抑制柱 与组分反应：R—H+ + NaX → R-Na+ + HX 与洗脱剂反应：R--H+ + NaOH → R-Na+ + H2O
强阳离子交换剂
弱阳离子交换剂
SCX
WCX
—SO3H
—COOH
强阴离子交换剂
弱阴离子交换剂
SAX
WAX
—N+R3
—NH2
（2）流动相----水缓冲溶液 选择规则 使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱;反之，则保留 时间增大，后出色谱柱 . （2）pH增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后
第3节 定性与定量分析技术 一、定性分析技术 1．色谱鉴定法 2．两谱联用鉴定法 LC-UV
LC-MS
二、定量测定分析(外标法、内标法） 1.加校正因子的主成分自身对照法 (1)校正因子测定与计算
A杂 / c杂 f A主 / c主
(2）测定 测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质 限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对 照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限） 或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色 谱峰的峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积 分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特 殊规定外，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰 保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面
颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。
1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μ m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10μ m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型担体
源自文库
（薄壳型微珠担体）
CITP
CEC NACE
区带前后使用两种 不同缓冲液
CZE载体+液相色 谱固定相 含电解质的非水体 系
离子型化合物
离子型化合物、有机物、大分 子、手性化合物 弱极性、中性分子，能与质谱 联用
毛细管电色谱 非水毛细管电泳
第5节 应用案例
一、分离方法初选
第4节 高效毛细管电泳简介 一、毛细管电泳分离原理简介 1.电泳流 (电泳) -----在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移
2.电渗流 （电渗) -----在一般性况下（pH＞3）石英毛 细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层;在高 压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方 向移动
管内填充物
pH缓冲的自由电 解质溶液（可 含添加剂） CZE载体+带电胶 束 电泳用凝胶或其它 筛分介质 pH梯度两性电解 质
分离分析对象
无机离子、有机物、对映体拆 分、各种生物分子 小分子、中性分子、对映体拆 分 蛋白质、核酸、聚合酶链反应 产物、寡聚核苷酸 等电点差异小的蛋白质、氨基 酸
毛细管等速电泳
1．色谱柱类型
制备型柱
内径20～40mm，柱长10～30cm
分析型
制备型
2．填充剂-----最常用填充剂为化学键合硅胶
四、检测系统 1.紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器结构与光路示意图
三维色谱图
介电型 ----测量两电极之间电容介质的介电 常数变化测得组分浓度
二、毛细管电泳仪的基本装置 毛细管柱、柱恒温 系统、电解液槽、 进样器、高压电源、 检测器和数据处理 器
毛细管电泳装置示意图
1．毛细管柱及温度控制 空心柱 ----区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳 （1）毛细管柱 填充毛细管柱 ---电色谱
壁处理柱 ----蛋白质电泳
作用---消除电泳产生的焦耳热 （2）毛细管恒温装置 精度---±0.1℃ 恒温方式 高速气流恒温 液体恒温
积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面 积比较，依法计算各杂质含量。
2．不加校正因子的主成分自身对照法 按上述（1）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，
取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量 标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应 为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图中 各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计 算杂质的含量。
2．电化学检测器 电导型 ---测电导率变化来测量电离物质含量 电位型 --测定电流为零时电极间的电位差值 安培型 ---测定电极间的电流变化而测定样 品浓度
典型电化学检测器示意图
3．蒸发光散射检测 ELSD是基于
光线通过微小 粒子时会产生 光散射的现象
蒸发光散射检测器工作原理示意图 五、数据记录及处理系统（类似于GC)
固定相：C1 固定相：C8 固定相：C18
时间，min
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯
（3）流动相的表面张力
流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；
溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱， 导致溶质的保留值大。 （4）流动相的酸碱性和盐浓度 酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增 加保留时间；盐浓度增加不利于离子化溶质保留。
R1 Si R2 Si OH + Cl C18 H37 -HCl Si O R1 Si R2 C18 H37
极性键合相 （键合-NH2、-CN、醇基等极性基团） 离子型键合相 （键合可交换阴或阳离子基团 )
2．分离原理 特征----固定相极性＞流动相极性 （1）正相键合相色谱法 流动相-----有机溶剂 分离机制 ---类似液-液分配色谱的分离原理 应用范围---适于分离溶于有机溶剂的 极性至中等极性的分子型化合物(如脂
(1)增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，
出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小， 先出柱。
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法 1．分离机制
在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离
子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性 或弱极性）的离子对缔合物 ,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相 被保留 .因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离 子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色 谱柱先后不同，实现分离.
4.4 高效液相色谱分离方式
液谱分离系统 液固吸附色谱
分配色谱
HPLC 分离方式 离子交换和离子色谱 离子对色谱 体积排阻色谱法 亲合色谱法
4.4.1 液谱分离系统 1、固定相（柱填料）
常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。 硅胶是HPLC 填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好 的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰 富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。 缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。 目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径 • 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析
溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）
（2）反相键合相色谱法
特征----固定相极性＜流动相极性 流动相-----水+有机调节剂 分离机制 ---“疏溶剂作用”理论 应用范围-----适用于分离非极性至
中等极性的分子型化合物
疏溶剂作用理论 利用非极性溶质分子或 溶质分子中非极性基团和极 性溶剂接触时产生排斥力， 而从溶剂中被“挤出”，即 产生疏溶剂作用，促使溶质 分子与键合相表面的非极性 的烷基发生疏水缔合，而使 溶质分子保留在固定相中 . 想一想 影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些?
电渗流的速度= 5~7倍电泳流速度 阳离子迁移速度＝电渗速度＋电泳速度 3.粒子迁移速度 阴离子迁移速度＝电渗速度－电泳速度 中性粒子迁移速度＝电渗速度
4.分离原理 在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子 电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离 子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实 现分离。
生成离子对反应
A-(水 相 ） + B+(水 相 ）
被测离子 反离子
A-B+(有 机 相 ）
烷基磺酸或盐类 (十二烷基磺酸钠 ）
阳离子
2．常用 离子对 试剂
分析有机碱类和有机阳离子 季铵盐类 (四丁基季铵盐、十六烷基三甲基季铵盐 ) 阴离子 分析有机酸和有机阴离子
3．固定相与流动相 (1）固定相 -----ODS等非极性固定相 (2）流动相 -----甲醇-水或乙腈-水体系中加入适量离子对试 剂，并用缓冲液调至合适的pH。分离有机碱的pH值一般为 3~3.5；分离有机酸的pH值一般在7.5左右。
(2）溶液控制系统 分部收集器 更换缓冲液装置 缓冲液的水平系统 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 质谱检测器 电化学检测器 激光类检测器
5．检测器
三、毛细管电泳法的模式及应用
名称
毛细管区带电泳 胶束电动毛细管电 泳 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦
缩写
CZE MEC C CGE CIEF
四元外梯度洗脱装置双泵(串联)工作原理示意图
等度洗脱 3．洗脱方式
梯度洗脱
想一想
分别在何种情况下选择等度或梯度洗脱? 二、进样系统 1．六通阀进样器
2．自动进样器
三、分离系统
分 析 型 柱 常量柱内径2～4.6mm，柱长10～25cm 半微量柱：内径1～1.5mm，柱长10～20cm 毛细管柱：内径0.5～1mm，柱长30～75mm
电压:0~30kV
直流电源 2．高压电源
稳定性:±0.1% 电流强度:200~300mA
电源极性切换装置 (双极性电源)
进样端加压进样 流体进样 3．毛细管电泳进样方法 出口端真空进样 高差进样 电动进样 （瞬间高压脉冲进样)
4．电极和溶液控制系统
(1）电极----置于两侧的电泳池中铂丝电极 自动进样器