第10章_高效液相色谱分离检测技术
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高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
•
• •
• •
防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
第10章 色谱分析基本概念
( t t R )2 2σ 2
c
c0 σ 2π
e
当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰 减函数构建关系式。
目 录
1-1 色谱法概述
1-1-1 色谱法的特点、分类和作用 1-1-2 色谱分离过程 1-1-3 色谱流出曲线与术语
1-2 色谱理论基础
1-2-1 塔板理论 1-2-2 速率理论 1-2-3 分离度 1-3 定性定量方法 1-3-1 色谱定性分析 1-3-2 色谱定量分析
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，
色谱柱的理论塔板数：n，
则三者的关系为： n=L/H
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
2.有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
调整保留时间（tR＇）：tR＇= tR－tM
（2）用体积表示的保留值 保留体积（VR）： VR = tR×F0 F0为柱出口处的载气流量，
单位：m L / min。
死体积（VM）：
VM = tM ×F0
调整保留体积(VR＇)：
V R＇ = VR －VM
3. 相对保留值r21 组分2与组分1调整保留值之比： r21 = t´R2 / t´R1= V´R2 / V´R1 相对保留值只与柱温 和固定相性质有关，与其 他色谱操作条件无关，它 表示了固定相对这两种组 分的选择性。
式中为相比。 填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。 容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积； 气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；
c
c0 σ 2π
e
当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰 减函数构建关系式。
目 录
1-1 色谱法概述
1-1-1 色谱法的特点、分类和作用 1-1-2 色谱分离过程 1-1-3 色谱流出曲线与术语
1-2 色谱理论基础
1-2-1 塔板理论 1-2-2 速率理论 1-2-3 分离度 1-3 定性定量方法 1-3-1 色谱定性分析 1-3-2 色谱定量分析
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，
色谱柱的理论塔板数：n，
则三者的关系为： n=L/H
理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
2.有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
调整保留时间（tR＇）：tR＇= tR－tM
（2）用体积表示的保留值 保留体积（VR）： VR = tR×F0 F0为柱出口处的载气流量，
单位：m L / min。
死体积（VM）：
VM = tM ×F0
调整保留体积(VR＇)：
V R＇ = VR －VM
3. 相对保留值r21 组分2与组分1调整保留值之比： r21 = t´R2 / t´R1= V´R2 / V´R1 相对保留值只与柱温 和固定相性质有关，与其 他色谱操作条件无关，它 表示了固定相对这两种组 分的选择性。
式中为相比。 填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。 容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积； 气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；
高效液相色谱分析
色 谱 泵 进 样 器
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱法
4. 区域宽度
衡量色谱峰宽度的参数，三种
表示方法： （ 1 ）标准偏差 ( ) ：即 0.607 倍峰 高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半 处的宽度 Y1/2 =2.354 。 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 。
2. 相平衡参数
（1）分配系数（ partition coefficient） K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”
气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为
液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作
用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争， 即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
试样一定时，K主要取决于固定相性质；
每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。
3.分配比 （partition radio）k
一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。
2. 按孔隙深度分
• 表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面 覆盖一层多孔活性材料(如 硅胶、氧化铝、离子交 换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的 颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好， 出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。 • 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成， 因颗粒极细，因而孔径小、传质快、 柱效高。特 别适于复杂混合物的分离。
（2）用体积表示的保 留值
保留体积（VR）： VR = tR×qv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM ×qv
高效液相色谱-电化学法_概述及解释说明
高效液相色谱-电化学法概述及解释说明1. 引言1.1 概述高效液相色谱-电化学法（简称HPLC-EC）是一种常用的分析技术，利用高效液相色谱技术和电化学检测原理相结合，实现对样品中化合物的分离和定量分析。
此方法具有灵敏度高、选择性好、重复性好等优点，因而在环境科学、生物医药和食品安全等领域得到广泛应用。
1.2 文章结构本文共分五个部分进行阐述。
引言部分是对整篇文章的概述，介绍了HPLC-EC 技术的背景和研究意义。
第二部分将对HPLC技术和电化学法以及它们之间的结合进行简要介绍。
接下来一节将详细讨论HPLC-EC的实验原理与分析过程。
第四部分将探讨HPLC-EC在环境污染物、生物医药和食品安全领域中的应用案例。
最后一节是总结与展望，回顾整篇文章所提到的内容，并展望该技术在未来发展中可能取得的进展。
1.3 目的本文旨在全面介绍高效液相色谱-电化学法的相关知识，深入探讨其原理及其在环境科学、生物医药和食品安全领域的应用。
通过文章阐述，读者可以对HPLC-EC技术有一个全面的了解，并且了解到该技术在不同领域的实际应用和发展趋势。
2. 高效液相色谱-电化学法概述：2.1 高效液相色谱技术简介高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于分析化学领域的分离技术。
它基于物质在溶剂流动下通过固定相的不同速率进行分离，可用于分析和检测各种化合物。
HPLC技术具有分离效果好、选择性强、重复性好等特点，因此被广泛应用于环境、生物医药和食品安全等领域的样品分析中。
2.2 电化学法简介电化学法是利用电极与溶液中存在的化学反应产生的电流或电势来检测或测定物质的一种方法。
根据所使用的电极类型和测量参数，常见的电化学方法包括极谱法、电化学滴定法、恒定电位法等。
这些方法可以实现对不同种类和浓度范围内的物质进行快速准确的检测和分析。
2.3 结合应用优势高效液相色谱-电化学法(HPLC-EC)是将HPLC技术与电化学方法相结合而形成的一种分析技术。
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱分离检测技术
(2)pH增大,酸得离解度增大而值增大,保留时间增加,后出柱;但 有机碱得离解度降低而分配比减小,保留时间减小,先出柱。
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法
1、分离机制
在反相色谱法中,将一种或多种与被测离子电荷相反得离子(称为对离子 或反离子)加到极性流动相中,使其与被测离子结合,形成疏水性(中性或弱极性) 得离子对缔合物 ,而被非极性固定相(有机相)萃取,进入固定相被保留 、因待测 组分离子得性质不同、反离子形成离子对得能力不同和形成离子对疏水性得 不同,导致各组分离子在固定相中滞留时间得不同,因而出色谱柱先后不同,实现 分离、
2、固定相与流动相
(1)固定相
基质 ---合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶 离子交换剂 ----键合得离子交换基团
类型
符号
官能团
强阳离子交换剂 弱阳离子交换剂
SCX WCX
—SO3H —COOH
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
SAX WAX
—N+R3 —NH2
(2)流动相----水缓冲溶液
选择规则 (1)增加流动相中盐得浓度,可以降低待测离子得竞争亲和力, 使其在固定相上得保留时间减少,先出色谱柱;反之,则保留时间 增大,后出色谱柱 、
2、不加校正因子得主成分自身对照法
按上述(1)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供 试品溶液和对照溶液适量,分别进样。除供试品质量标准项 下有特别规定外,供试品溶液色谱图记录得时间应为主成分 色谱峰保留时间得2倍,测量供试品溶液色谱图中各杂质得峰 面积并与对照溶液得主成分得峰面积比较,计算杂质得含量。
在无抑制柱得离子交换色谱中,进入检测器得就是高电导得洗脱剂 NaOH及被洗脱得组分NaX,后者所产生得电导得微小变化被洗脱剂得高本 底所淹没,难于检测。而加了抑制柱后,进入检测器得本底就是电导率很低 得水,因此很容易检测出具有较大电导率得HX。
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法
1、分离机制
在反相色谱法中,将一种或多种与被测离子电荷相反得离子(称为对离子 或反离子)加到极性流动相中,使其与被测离子结合,形成疏水性(中性或弱极性) 得离子对缔合物 ,而被非极性固定相(有机相)萃取,进入固定相被保留 、因待测 组分离子得性质不同、反离子形成离子对得能力不同和形成离子对疏水性得 不同,导致各组分离子在固定相中滞留时间得不同,因而出色谱柱先后不同,实现 分离、
2、固定相与流动相
(1)固定相
基质 ---合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶 离子交换剂 ----键合得离子交换基团
类型
符号
官能团
强阳离子交换剂 弱阳离子交换剂
SCX WCX
—SO3H —COOH
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
SAX WAX
—N+R3 —NH2
(2)流动相----水缓冲溶液
选择规则 (1)增加流动相中盐得浓度,可以降低待测离子得竞争亲和力, 使其在固定相上得保留时间减少,先出色谱柱;反之,则保留时间 增大,后出色谱柱 、
2、不加校正因子得主成分自身对照法
按上述(1)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供 试品溶液和对照溶液适量,分别进样。除供试品质量标准项 下有特别规定外,供试品溶液色谱图记录得时间应为主成分 色谱峰保留时间得2倍,测量供试品溶液色谱图中各杂质得峰 面积并与对照溶液得主成分得峰面积比较,计算杂质得含量。
在无抑制柱得离子交换色谱中,进入检测器得就是高电导得洗脱剂 NaOH及被洗脱得组分NaX,后者所产生得电导得微小变化被洗脱剂得高本 底所淹没,难于检测。而加了抑制柱后,进入检测器得本底就是电导率很低 得水,因此很容易检测出具有较大电导率得HX。
高效液相色谱分析HPLC
高效液相色谱
第18页
第7讲
高效液相色谱
第19页
§3-4 液相色谱法固定相
色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键。 一、液-液色谱法及离子对色谱法固定相 1.全多孔型担体：直径小于10µm（75/-4） 2.表面多孔型担体，目前不用。 3.化学键合固定相（P76及P69） a.成相：用化学的方法通过化学键把有机分子结合 到担体表面。常用18碳柱 b.特点76/-5：4点. 4.分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型 的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是 按键合量的多少而各有侧重.
第7讲
高效液相色谱
第16页
离子对色谱分离过程示意图
第7讲
高效液相色谱
第17页
五、离子色谱法 1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2 3.分离机制 （阴离子为例） a.双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从 有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.
高效液相色谱
第1页
第三章
高效液相色谱分析（HPLC）
§3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20 多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g
高效液相色谱
第Байду номын сангаас页
第7讲
高效液相色谱
第7页
高效液相色谱实验技术问题解答
高效液相色谱实验技术问题解答高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。
1、高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的? 解：气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏渡得到启发，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱曲缺点，从而达到高效、快速、灵敏。
2、与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足? 解：气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。
因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。
而高效液相色谱由于以液体作为流动相，只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度，便可以分析，所以适用性广，不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如，生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。
在目前已知的有机化台物中，只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。
气相色谱中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物多，选择余地广。
与气相色谱相比，高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易，只要开口容器放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。
回收是定量的，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
高效液相色谱不足的是，日前检测器的灵敏度不及气相色谱。
必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
3、试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线，分析产生不同的原因。
解：从图可看出，气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线，形状迥然不同，流动相的流速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的H-u曲线上，塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点，这时柱效最高，板高最小，流速最佳。
高效液相色谱法
31
特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
32
2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
33
四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
11
第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
高效液相色谱技术(HPLC)
溶质在固定相中的量 溶质在流动相中的量
ab
• “ k’ ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子
的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动
相
的分
配
性
质、
柱
温 以 及 k ,＝ tR－t0 t0
相空
间
比
（
即
固
定相
和流动相之体企积比）有关。“ k’ ”又定义为
在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消
除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是
⑸选择性指标“α’ ”和相对保留值“α”
α’ 可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏：
α'＝ tR(2)
进样 tR(1)
tR(2)
tR (1)
相对保留值α(分离因子)：
α＝ t' R(2) ＝ k ' (2) ( α＞1.1为好 ) t' R(1) k ' (1)
• 2. 柱效率：
•
定义：
理论塔板数
• 键合相使用硅胶作基质的优点是：
①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和 表面积易人为控制；③化学稳定性好。
• 硅胶 ( SiO2•n H2O) ：
OH OH —Si—O—Si—
｜｜
• 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的 产物。
• 最常用的键合相键型是： ｜ ｜
—Si—O—Si—C
平衡时物质在两相中的浓度比。
• k’值的范围： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5 为佳，过大则耗时太长。
⑷保留体积：VR＝tR•FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－VR0＝tR’ •FC
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
液相色谱法
10.3 各类高效液相色谱法>>
10.3.3 化学键合色谱法>>3.离子对色谱法
离子对色谱(ion pair chormatography，IPC) 在流动相中加入与被测离子相反电荷的离子对试剂， 使之形成中性的离子对化合物，从而增加样品离子 在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，分 离改善。分配系数的大小主要取决于离子对化合物 的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。 ⑴ 常用离子对试剂 分离碱类：用烷基磺酸盐为离子对试剂。如十二烷 基磺酸钠，正戊/己/庚/辛磺酸钠(PIC-B5/6/7/8)等。 分离酸类：用四丁基季铵盐(PIC-A) ，如四丁基胺 磷酸盐(TBA)等。
1
10.3 各类高效液相色谱法
10.3.1 吸附色谱法(LSC) 10.3.2 分配色谱法(LLC) 10.3.3 化学键合色谱法(BPC) 10.3.4 其他色谱法
10.3 各类高效液相色谱法>>
10.3.1 吸附色谱法 LSC
1. 分离机理 吸附色谱法是被分离的组分分子(溶质 分子)与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，因 溶质分子的吸附系数的差别而分离。 2. 影响容量因子(k)的因素 以硅胶吸附剂为例： ⑴ 硅胶与溶质分子的亲和力顺序：k大者后出峰。 kmin→饱和烃＜芳烃＜…＜酯醛酮＜…＜羧酸→kmax ⑵ 溶质的极性：常用流动相是以烷烃为底剂，加入适 当的极性溶剂组成二元或多元溶剂系统，从而能调 整溶解的极性，控制组分的保留时间。溶剂系统的 极性越大，洗脱力越强。
十八烷基硅烷 O 键合相ODS
+
10.3 各类高效液相色谱法>>
10.3.3 化学键合色谱法
1. 2. 3. 4. 5. 反相键合相色谱法，RBPC 正相键合色谱法， NBPC 离子对色谱法，IPC or. PIC 离子抑制色谱法，ISC 其他色谱法
高效液相色谱检测技术
高效液相色谱法特点
高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到 的阻 力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达 150-350 ×105Pa。
高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱 法高得多，一般可达1-10mL/min。
高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米 ，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。
高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、 全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验， 并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现 在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪 器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液 收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以 及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高
液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检 测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还 可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进 样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。
液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或 压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入, 流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分 配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测
高灵敏度：采用高灵敏度的检测器，进一步提高 了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11 g 。
HPLC主要知名品牌
• 沃特斯（Waters • 安捷伦（Agilent） • 岛津（Shimazu） • 其它：戴安、菲尼根、热电等。
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二、毛细管电泳仪的基本装置 毛细管柱、柱恒温 系统、电解液槽、 进样器、高压电源、 检测器和数据处理 器
毛细管电泳装置示意图
1．毛细管柱及温度控制 空心柱 ----区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳 （1）毛细管柱 填充毛细管柱 ---电色谱
壁处理柱 ----蛋白质电泳
作用---消除电泳产生的焦耳热 （2）毛细管恒温装置 精度---±0.1℃ 恒温方式 高速气流恒温 液体恒温
CITP
CEC NACE
区带前后使用两种 不同缓冲液
CZE载体+液相色 谱固定相 含电解质的非水体 系
离子型化合物
离子型化合物、有机物、大分 子、手性化合物 弱极性、中性分子，能与质谱 联用
毛细管电色谱 非水毛细管电泳
第5节 应用案例
一、分离方法初选
1．色谱柱类型
制备型柱
内径20～40mm，柱长10～30cm
分析型
制备型
2．填充剂-----最常用填充剂为化学键合硅胶
四、检测系统 1.紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵介电型 ----测量两电极之间电容介质的介电 常数变化测得组分浓度
电压:0~30kV
直流电源 2．高压电源
稳定性:±0.1% 电流强度:200~300mA
电源极性切换装置 (双极性电源)
进样端加压进样 流体进样 3．毛细管电泳进样方法 出口端真空进样 高差进样 电动进样 （瞬间高压脉冲进样)
4．电极和溶液控制系统
(1）电极----置于两侧的电泳池中铂丝电极 自动进样器
4.4 高效液相色谱分离方式
液谱分离系统 液固吸附色谱
分配色谱
HPLC 分离方式 离子交换和离子色谱 离子对色谱 体积排阻色谱法 亲合色谱法
4.4.1 液谱分离系统 1、固定相（柱填料）
常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。 硅胶是HPLC 填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好 的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰 富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。 缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。 目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径 • 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析
电渗流的速度= 5~7倍电泳流速度 阳离子迁移速度＝电渗速度＋电泳速度 3.粒子迁移速度 阴离子迁移速度＝电渗速度－电泳速度 中性粒子迁移速度＝电渗速度
4.分离原理 在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子 电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离 子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实 现分离。
第2节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪结构及流程
一、输液系统 恒压泵(淘汰)
1．高压输液泵
恒流泵
单柱塞往复泵 双柱塞往复泵(串或并联）
单柱塞往复泵结构示意图
内梯度----高压泵将溶剂按程序压入混合室， 2．梯度洗脱装置
混合后再注入色谱柱
外梯度---多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱
二 元 内 梯 度 洗 脱 装 置 示 意 图
(2）溶液控制系统 分部收集器 更换缓冲液装置 缓冲液的水平系统 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 质谱检测器 电化学检测器 激光类检测器
5．检测器
三、毛细管电泳法的模式及应用
名称
毛细管区带电泳 胶束电动毛细管电 泳 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦
缩写
CZE MEC C CGE CIEF
30～40μ m的玻璃微球，表面附着 一层厚度为1 ～ 2μ m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底。
4.4.1 液谱分离系统 液-固色谱法（LSC） 固定相状态分 液-液色谱法（LLC） 吸附色谱法 HPLC
分配色谱法
离子交换色谱法 分离机制分 分子排阻色谱法 化学键合相色谱法 亲合色谱法
离子色谱法
固定相：C1 固定相：C8 固定相：C18
时间，min
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯
（3）流动相的表面张力
流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；
溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱， 导致溶质的保留值大。 （4）流动相的酸碱性和盐浓度 酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增 加保留时间；盐浓度增加不利于离子化溶质保留。
在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂 NaOH及被洗脱的组分NaX，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高 本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率 很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。
2．固定相与流动相 基质 ---合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 （1）固定相 类型 离子交换剂 ----键合的离子交换基团 符号 官能团
积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面 积比较，依法计算各杂质含量。
2．不加校正因子的主成分自身对照法 按上述（1）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，
取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量 标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应 为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图中 各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计 算杂质的含量。
强阳离子交换剂
弱阳离子交换剂
SCX
WCX
—SO3H
—COOH
强阴离子交换剂
弱阴离子交换剂
SAX
WAX
—N+R3
—NH2
（2）流动相----水缓冲溶液 选择规则 使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱;反之，则保留 时间增大，后出色谱柱 . （2）pH增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后
R1 Si R2 Si OH + Cl C18 H37 -HCl Si O R1 Si R2 C18 H37
极性键合相 （键合-NH2、-CN、醇基等极性基团） 离子型键合相 （键合可交换阴或阳离子基团 )
2．分离原理 特征----固定相极性＞流动相极性 （1）正相键合相色谱法 流动相-----有机溶剂 分离机制 ---类似液-液分配色谱的分离原理 应用范围---适于分离溶于有机溶剂的 极性至中等极性的分子型化合物(如脂
第4节 高效毛细管电泳简介 一、毛细管电泳分离原理简介 1.电泳流 (电泳) -----在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移
2.电渗流 （电渗) -----在一般性况下（pH＞3）石英毛 细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层;在高 压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方 向移动
第3节 定性与定量分析技术 一、定性分析技术 1．色谱鉴定法 2．两谱联用鉴定法 LC-UV
LC-MS
二、定量测定分析(外标法、内标法） 1.加校正因子的主成分自身对照法 (1)校正因子测定与计算
A杂 / c杂 f A主 / c主
(2）测定 测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质 限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对 照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限） 或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色 谱峰的峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积 分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特 殊规定外，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰 保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面
颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。
1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μ m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10μ m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体）
2．电化学检测器 电导型 ---测电导率变化来测量电离物质含量 电位型 --测定电流为零时电极间的电位差值 安培型 ---测定电极间的电流变化而测定样 品浓度
典型电化学检测器示意图
3．蒸发光散射检测 ELSD是基于
光线通过微小 粒子时会产生 光散射的现象
蒸发光散射检测器工作原理示意图 五、数据记录及处理系统（类似于GC)
溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）
（2）反相键合相色谱法
特征----固定相极性＜流动相极性 流动相-----水+有机调节剂 分离机制 ---“疏溶剂作用”理论 应用范围-----适用于分离非极性至
中等极性的分子型化合物
疏溶剂作用理论 利用非极性溶质分子或 溶质分子中非极性基团和极 性溶剂接触时产生排斥力， 而从溶剂中被“挤出”，即 产生疏溶剂作用，促使溶质 分子与键合相表面的非极性 的烷基发生疏水缔合，而使 溶质分子保留在固定相中 . 想一想 影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些?
(1)增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，
出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小， 先出柱。
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法 1．分离机制
在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离
子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性 或弱极性）的离子对缔合物 ,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相 被保留 .因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离 子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色 谱柱先后不同，实现分离.
生成离子对反应
A-(水 相 ） + B+(水 相 ）
毛细管电泳装置示意图
1．毛细管柱及温度控制 空心柱 ----区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳 （1）毛细管柱 填充毛细管柱 ---电色谱
壁处理柱 ----蛋白质电泳
作用---消除电泳产生的焦耳热 （2）毛细管恒温装置 精度---±0.1℃ 恒温方式 高速气流恒温 液体恒温
CITP
CEC NACE
区带前后使用两种 不同缓冲液
CZE载体+液相色 谱固定相 含电解质的非水体 系
离子型化合物
离子型化合物、有机物、大分 子、手性化合物 弱极性、中性分子，能与质谱 联用
毛细管电色谱 非水毛细管电泳
第5节 应用案例
一、分离方法初选
1．色谱柱类型
制备型柱
内径20～40mm，柱长10～30cm
分析型
制备型
2．填充剂-----最常用填充剂为化学键合硅胶
四、检测系统 1.紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵介电型 ----测量两电极之间电容介质的介电 常数变化测得组分浓度
电压:0~30kV
直流电源 2．高压电源
稳定性:±0.1% 电流强度:200~300mA
电源极性切换装置 (双极性电源)
进样端加压进样 流体进样 3．毛细管电泳进样方法 出口端真空进样 高差进样 电动进样 （瞬间高压脉冲进样)
4．电极和溶液控制系统
(1）电极----置于两侧的电泳池中铂丝电极 自动进样器
4.4 高效液相色谱分离方式
液谱分离系统 液固吸附色谱
分配色谱
HPLC 分离方式 离子交换和离子色谱 离子对色谱 体积排阻色谱法 亲合色谱法
4.4.1 液谱分离系统 1、固定相（柱填料）
常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。 硅胶是HPLC 填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好 的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰 富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。 缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。 目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径 • 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析
电渗流的速度= 5~7倍电泳流速度 阳离子迁移速度＝电渗速度＋电泳速度 3.粒子迁移速度 阴离子迁移速度＝电渗速度－电泳速度 中性粒子迁移速度＝电渗速度
4.分离原理 在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子 电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离 子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实 现分离。
第2节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪结构及流程
一、输液系统 恒压泵(淘汰)
1．高压输液泵
恒流泵
单柱塞往复泵 双柱塞往复泵(串或并联）
单柱塞往复泵结构示意图
内梯度----高压泵将溶剂按程序压入混合室， 2．梯度洗脱装置
混合后再注入色谱柱
外梯度---多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱
二 元 内 梯 度 洗 脱 装 置 示 意 图
(2）溶液控制系统 分部收集器 更换缓冲液装置 缓冲液的水平系统 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 质谱检测器 电化学检测器 激光类检测器
5．检测器
三、毛细管电泳法的模式及应用
名称
毛细管区带电泳 胶束电动毛细管电 泳 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦
缩写
CZE MEC C CGE CIEF
30～40μ m的玻璃微球，表面附着 一层厚度为1 ～ 2μ m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底。
4.4.1 液谱分离系统 液-固色谱法（LSC） 固定相状态分 液-液色谱法（LLC） 吸附色谱法 HPLC
分配色谱法
离子交换色谱法 分离机制分 分子排阻色谱法 化学键合相色谱法 亲合色谱法
离子色谱法
固定相：C1 固定相：C8 固定相：C18
时间，min
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯
（3）流动相的表面张力
流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；
溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱， 导致溶质的保留值大。 （4）流动相的酸碱性和盐浓度 酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增 加保留时间；盐浓度增加不利于离子化溶质保留。
在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂 NaOH及被洗脱的组分NaX，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高 本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率 很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。
2．固定相与流动相 基质 ---合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 （1）固定相 类型 离子交换剂 ----键合的离子交换基团 符号 官能团
积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面 积比较，依法计算各杂质含量。
2．不加校正因子的主成分自身对照法 按上述（1）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，
取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量 标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应 为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图中 各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计 算杂质的含量。
强阳离子交换剂
弱阳离子交换剂
SCX
WCX
—SO3H
—COOH
强阴离子交换剂
弱阴离子交换剂
SAX
WAX
—N+R3
—NH2
（2）流动相----水缓冲溶液 选择规则 使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱;反之，则保留 时间增大，后出色谱柱 . （2）pH增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后
R1 Si R2 Si OH + Cl C18 H37 -HCl Si O R1 Si R2 C18 H37
极性键合相 （键合-NH2、-CN、醇基等极性基团） 离子型键合相 （键合可交换阴或阳离子基团 )
2．分离原理 特征----固定相极性＞流动相极性 （1）正相键合相色谱法 流动相-----有机溶剂 分离机制 ---类似液-液分配色谱的分离原理 应用范围---适于分离溶于有机溶剂的 极性至中等极性的分子型化合物(如脂
第4节 高效毛细管电泳简介 一、毛细管电泳分离原理简介 1.电泳流 (电泳) -----在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移
2.电渗流 （电渗) -----在一般性况下（pH＞3）石英毛 细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层;在高 压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方 向移动
第3节 定性与定量分析技术 一、定性分析技术 1．色谱鉴定法 2．两谱联用鉴定法 LC-UV
LC-MS
二、定量测定分析(外标法、内标法） 1.加校正因子的主成分自身对照法 (1)校正因子测定与计算
A杂 / c杂 f A主 / c主
(2）测定 测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质 限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对 照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限） 或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色 谱峰的峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积 分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特 殊规定外，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰 保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面
颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。
1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μ m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10μ m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体）
2．电化学检测器 电导型 ---测电导率变化来测量电离物质含量 电位型 --测定电流为零时电极间的电位差值 安培型 ---测定电极间的电流变化而测定样 品浓度
典型电化学检测器示意图
3．蒸发光散射检测 ELSD是基于
光线通过微小 粒子时会产生 光散射的现象
蒸发光散射检测器工作原理示意图 五、数据记录及处理系统（类似于GC)
溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）
（2）反相键合相色谱法
特征----固定相极性＜流动相极性 流动相-----水+有机调节剂 分离机制 ---“疏溶剂作用”理论 应用范围-----适用于分离非极性至
中等极性的分子型化合物
疏溶剂作用理论 利用非极性溶质分子或 溶质分子中非极性基团和极 性溶剂接触时产生排斥力， 而从溶剂中被“挤出”，即 产生疏溶剂作用，促使溶质 分子与键合相表面的非极性 的烷基发生疏水缔合，而使 溶质分子保留在固定相中 . 想一想 影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些?
(1)增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，
出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小， 先出柱。
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法 1．分离机制
在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离
子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性 或弱极性）的离子对缔合物 ,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相 被保留 .因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离 子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色 谱柱先后不同，实现分离.
生成离子对反应
A-(水 相 ） + B+(水 相 ）