第二节 液相色谱检测方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4.2 高效液相色谱检测方法
HPLC与GC的区别 液相色谱仪器及操作
气相色谱与液相色谱的比较
类别 流动相 固定相 气相色谱 气体(He,N2,H2) 多（数百种） 液相色谱 液体 较少（十几种）
分析对象
检测技术 制备分离
ห้องสมุดไป่ตู้
可挥发且热稳定，沸点 不受样品挥发性和稳定 <500℃ 性的限制 多（FID，ECD，NPD， 少（UV-Vis，荧光， FPD，MS） 电化学，MS） 烦琐 简便
高效液相色谱仪的日常维护
对流动相的要求： 流动相必须经过0.45µ m的滤膜过滤并脱气后才能上 机使用。 在分析柱前要加装保护柱。 注意用超声波清洗器定期在稀硝酸或甲醇中清洗过 滤头。 进样系统的维护： 使用指定的进样器，防止进样器针头划伤阀体。 在农药残留分析周期内，不要进行有干扰的常量分 析。
结构 蒸发光散射检测器由雾化部件、流动相蒸发部件、 目标化合物检测系统三部分组成。
使用及注意事项： 操作只涉及两个参数，雾化载气流压力和蒸 发器温度。 雾化载气流压力影响雾化器中液滴的形成， 信噪比随压力升高而升高。 检测灵敏度随蒸发器温度升高而加大。 流动相蒸发趋向完全，信噪比上升。 工作时必需备有氮气发生器，空气压缩机等 供气源，且必须在装有排风设备的屋内使用。
结构 荧光检测器包括激发光源、选择激发波长用 的单色器，流通池、选择发射波长用的单色 器及光电检测器。 使用注意事项： 流通池容易被污染，必要时可以用铬酸洗液 浸泡过夜。 常用于荧光检测器检测的农药品种有苯并咪 唑类农药、甲基吡恶磷、多菌灵、涕必灵等。
电化学检测器
电化学检测器（electrochemical detector, ECh）是 根据点化学原理和物质的电化学性质进行检测的。 属于通用型检测器，对那些没有紫外吸收或不能 发出荧光但具有电活性的农药，可采用电化学检 测法。主要有 安培检测器：以测量电解电流的大小为基础。 电导检测器：以测量液体的电阻变化为根据。
正相柱
反相柱
检测系统
检测系统由独立的检测器或附属部件构成。功能 是将物理或化学特性转变为可处理的电信号。 常用检测器主要有： 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 电化学检测器 质谱检测器 蒸发光散射检测器
紫外-可见光检测器
紫可见光检测器（ultraviolet-visible detector,UV-VIS）又称紫外 检测器，是液相色谱仪应用最广泛的检测器，既可测 190~350nm光谱范围的紫外光吸收变化，又可向350~900nm 光谱范围延伸。 特点： 灵敏度高：最小检出量可达10-12g。 噪声低，对流动相基本无相应。 属于选择性检测器，对无紫外吸收的物质五相应。 属于非破坏性检测器，可用于制备色谱或与其他检测器联用， 结构简单，操作方便，便于维修。
高压输液泵： 多用不锈钢、聚四氟乙烯材料制造，泵的活塞多采 用石英 杆制成。 往复式柱塞泵 恒流泵｛ 高压输液泵｛ 注射泵 恒压泵：气动放大泵 液缸内不能进入气泡或进入后要及时排出。柱塞密封垫是易 损件，泵漏液时必须更换。 梯度洗脱装置： 梯度洗脱就是将两种或两种以上的不同极性的容易进行混合， 作为流动相使用。 低压洗脱：泵前混合 梯度洗脱｛ 高压洗脱：泵后混合
结构： 紫外检测器由光源、分光系统、流通池和检测系统 四大部分组成。 光源：由氘灯（195~400nm）和钨灯 （400~850nm）组成。 分光系统：包括聚光镜、狭缝机构和单色器（光 栅）。 使用注意事项： 日常分析结束后，要用甲醇或乙腈清洗色谱柱和检 测室20min以上。 严防检测器出口堵塞，导致压力过高，石英测量池 爆裂。
常见的商品牌号色谱柱
分离类型 填料 Hypersil CN, 5μ m Hypersil NH2, 5μ m Zorbax NH2, 5μ m Hypersil ODS-2(C18),5μ m Hypersil C18-BDS, 3 μ m Kromasil C18, 5 μ m 规格(柱长/内径,mm） 250×4.6 250×4.6 250×4.6 250×4.6 150×4.6 250×4.6
工作原理： 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光辐射通过物质溶 液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光 物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。
A=εbc
A为吸光度；ε为样品的摩尔吸光系数；b为光程长；c为样品 的浓度。
待测农药对紫外光吸收的特性取决于农药的分子结 构（存在生色团、助色团（羟基、胺基等））。 在选择检测波长时，通常选择该农药分子的最大吸 收波长，有时也综合考虑流动相杂质的影响。
高效液相色谱仪器及操作
HPLC由输液系统、进样系统、分离系统、 检测系统和数据处理系统组成。
输液系统
输液系统是给分离系统提供稳定的能将混合组分分 离的高压液体。 贮液器：玻璃或聚四氟乙烯衬里的塑料容器，容积 0.5~2L。 置于贮液器底部的输液导管需安装孔径10µ m的不锈 钢质或铝质或聚四氟乙烯的过滤头。 流动相在转入贮液器前必须过滤（0.45µ m的微孔膜） 和脱气（在线脱气和离线脱气）。 脱气装置：在线脱气装置装有加热器、温度调节器 和磁力搅拌器。
液相色谱常用检测器性能比较
规格 紫外(UV) 荧光(FLD) 专用 能 105 10-14 无 低 荧光度 电化学(ECh) 蒸发光散射 （ELSD) 通用 不能 105 10-8 有 2% 电导率， µs/cm 通用 能 106 10-9 无 低 光散射
类型 专用 梯度洗脱 能 104 线性范围 10-11 最小检出量(g) 对流速敏感性 无 对温度敏感性 低 信号单位 吸光度，A
进样系统
进样系统通常由手动六通进样阀或自动进 样器组成。可实现取样、进样两个目的。 直接注射器进样 进样技术｛ 停留进样 阀进样：装有定量管
分离系统
分离系统包括保护柱、分析柱及柱恒温箱。是色 谱仪的核心部分。 保护柱：保护分析柱的作用。应定期清洗或弃掉。 分析柱：通常为优质不锈钢制成，内径均匀，抛 光，五轴向沟槽。 常用色谱柱内径4.6mm，长20~25cm，填料粒度 通常为3~10µ m。
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器（evaporative light-scatter detector,ELSD） 标志着高效液相色谱仪高灵敏度、通用型质量检测器的诞生。 工作原理 当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会发生光散射现象。 在一定的角度测得的光散射强度与烟雾粒子大小和数量成正 比。理论上可以检测挥发性低于流动相的所有化合物。 经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，利用高速气流 喷成一薄雾，雾化为微小液滴的流动相进入加热的蒸发器蒸 发，不挥发的目标化合物微粒化后进入光路发生光散射，散 射光被光电倍增管捕获检测。
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器(diode array detector,DAD) 可以获得吸光度、时间、波长的三维光谱色 谱图。可以做出任意时间下的吸光度-波长 曲线。 工作原理：令光线先通过样品流通池，然后 由一系列分光技术，使所有波长的光在接 收器上同时被检测。
结构：
荧光检测器
荧光检测器(fluorescence detector,FLD)灵敏度极高，最小 检出量可达10-14g，具有良好的选择性（具对称共轭体系 的分子），能够避免不发荧光的成分干扰。 工作原理 化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波 长长的特征辐射，当入射光停止照射时，特征辐射也很快 消失，这种辐射光线就是荧光。被化合物吸收的光称为激 发光，产生的荧光称为发射光（一般为可见光）。 在相对条件下，物质的荧光强度与该物质溶液的浓度成正 比（定量依据）。
色谱柱的日常维护： 每次开机时，流量要逐渐增强或降低，避免突然增 压或降压，使柱床受到冲击，产生空隙。 在使用缓冲溶液做流动相时，更换甲醇前，一定要 用水将盐冲洗干净，否则盐沉积可能导致色谱柱彻 底堵塞报废。 每次实验结束后，反相色谱操作方式要用纯甲醇或 乙腈冲洗色谱柱20min以上才能关机。 拆卸后的色谱柱两端用盲头螺丝拧紧，防止封存的 溶剂挥发。
HPLC与GC的区别 液相色谱仪器及操作
气相色谱与液相色谱的比较
类别 流动相 固定相 气相色谱 气体(He,N2,H2) 多（数百种） 液相色谱 液体 较少（十几种）
分析对象
检测技术 制备分离
ห้องสมุดไป่ตู้
可挥发且热稳定，沸点 不受样品挥发性和稳定 <500℃ 性的限制 多（FID，ECD，NPD， 少（UV-Vis，荧光， FPD，MS） 电化学，MS） 烦琐 简便
高效液相色谱仪的日常维护
对流动相的要求： 流动相必须经过0.45µ m的滤膜过滤并脱气后才能上 机使用。 在分析柱前要加装保护柱。 注意用超声波清洗器定期在稀硝酸或甲醇中清洗过 滤头。 进样系统的维护： 使用指定的进样器，防止进样器针头划伤阀体。 在农药残留分析周期内，不要进行有干扰的常量分 析。
结构 蒸发光散射检测器由雾化部件、流动相蒸发部件、 目标化合物检测系统三部分组成。
使用及注意事项： 操作只涉及两个参数，雾化载气流压力和蒸 发器温度。 雾化载气流压力影响雾化器中液滴的形成， 信噪比随压力升高而升高。 检测灵敏度随蒸发器温度升高而加大。 流动相蒸发趋向完全，信噪比上升。 工作时必需备有氮气发生器，空气压缩机等 供气源，且必须在装有排风设备的屋内使用。
结构 荧光检测器包括激发光源、选择激发波长用 的单色器，流通池、选择发射波长用的单色 器及光电检测器。 使用注意事项： 流通池容易被污染，必要时可以用铬酸洗液 浸泡过夜。 常用于荧光检测器检测的农药品种有苯并咪 唑类农药、甲基吡恶磷、多菌灵、涕必灵等。
电化学检测器
电化学检测器（electrochemical detector, ECh）是 根据点化学原理和物质的电化学性质进行检测的。 属于通用型检测器，对那些没有紫外吸收或不能 发出荧光但具有电活性的农药，可采用电化学检 测法。主要有 安培检测器：以测量电解电流的大小为基础。 电导检测器：以测量液体的电阻变化为根据。
正相柱
反相柱
检测系统
检测系统由独立的检测器或附属部件构成。功能 是将物理或化学特性转变为可处理的电信号。 常用检测器主要有： 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 电化学检测器 质谱检测器 蒸发光散射检测器
紫外-可见光检测器
紫可见光检测器（ultraviolet-visible detector,UV-VIS）又称紫外 检测器，是液相色谱仪应用最广泛的检测器，既可测 190~350nm光谱范围的紫外光吸收变化，又可向350~900nm 光谱范围延伸。 特点： 灵敏度高：最小检出量可达10-12g。 噪声低，对流动相基本无相应。 属于选择性检测器，对无紫外吸收的物质五相应。 属于非破坏性检测器，可用于制备色谱或与其他检测器联用， 结构简单，操作方便，便于维修。
高压输液泵： 多用不锈钢、聚四氟乙烯材料制造，泵的活塞多采 用石英 杆制成。 往复式柱塞泵 恒流泵｛ 高压输液泵｛ 注射泵 恒压泵：气动放大泵 液缸内不能进入气泡或进入后要及时排出。柱塞密封垫是易 损件，泵漏液时必须更换。 梯度洗脱装置： 梯度洗脱就是将两种或两种以上的不同极性的容易进行混合， 作为流动相使用。 低压洗脱：泵前混合 梯度洗脱｛ 高压洗脱：泵后混合
结构： 紫外检测器由光源、分光系统、流通池和检测系统 四大部分组成。 光源：由氘灯（195~400nm）和钨灯 （400~850nm）组成。 分光系统：包括聚光镜、狭缝机构和单色器（光 栅）。 使用注意事项： 日常分析结束后，要用甲醇或乙腈清洗色谱柱和检 测室20min以上。 严防检测器出口堵塞，导致压力过高，石英测量池 爆裂。
常见的商品牌号色谱柱
分离类型 填料 Hypersil CN, 5μ m Hypersil NH2, 5μ m Zorbax NH2, 5μ m Hypersil ODS-2(C18),5μ m Hypersil C18-BDS, 3 μ m Kromasil C18, 5 μ m 规格(柱长/内径,mm） 250×4.6 250×4.6 250×4.6 250×4.6 150×4.6 250×4.6
工作原理： 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光辐射通过物质溶 液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光 物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。
A=εbc
A为吸光度；ε为样品的摩尔吸光系数；b为光程长；c为样品 的浓度。
待测农药对紫外光吸收的特性取决于农药的分子结 构（存在生色团、助色团（羟基、胺基等））。 在选择检测波长时，通常选择该农药分子的最大吸 收波长，有时也综合考虑流动相杂质的影响。
高效液相色谱仪器及操作
HPLC由输液系统、进样系统、分离系统、 检测系统和数据处理系统组成。
输液系统
输液系统是给分离系统提供稳定的能将混合组分分 离的高压液体。 贮液器：玻璃或聚四氟乙烯衬里的塑料容器，容积 0.5~2L。 置于贮液器底部的输液导管需安装孔径10µ m的不锈 钢质或铝质或聚四氟乙烯的过滤头。 流动相在转入贮液器前必须过滤（0.45µ m的微孔膜） 和脱气（在线脱气和离线脱气）。 脱气装置：在线脱气装置装有加热器、温度调节器 和磁力搅拌器。
液相色谱常用检测器性能比较
规格 紫外(UV) 荧光(FLD) 专用 能 105 10-14 无 低 荧光度 电化学(ECh) 蒸发光散射 （ELSD) 通用 不能 105 10-8 有 2% 电导率， µs/cm 通用 能 106 10-9 无 低 光散射
类型 专用 梯度洗脱 能 104 线性范围 10-11 最小检出量(g) 对流速敏感性 无 对温度敏感性 低 信号单位 吸光度，A
进样系统
进样系统通常由手动六通进样阀或自动进 样器组成。可实现取样、进样两个目的。 直接注射器进样 进样技术｛ 停留进样 阀进样：装有定量管
分离系统
分离系统包括保护柱、分析柱及柱恒温箱。是色 谱仪的核心部分。 保护柱：保护分析柱的作用。应定期清洗或弃掉。 分析柱：通常为优质不锈钢制成，内径均匀，抛 光，五轴向沟槽。 常用色谱柱内径4.6mm，长20~25cm，填料粒度 通常为3~10µ m。
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器（evaporative light-scatter detector,ELSD） 标志着高效液相色谱仪高灵敏度、通用型质量检测器的诞生。 工作原理 当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会发生光散射现象。 在一定的角度测得的光散射强度与烟雾粒子大小和数量成正 比。理论上可以检测挥发性低于流动相的所有化合物。 经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，利用高速气流 喷成一薄雾，雾化为微小液滴的流动相进入加热的蒸发器蒸 发，不挥发的目标化合物微粒化后进入光路发生光散射，散 射光被光电倍增管捕获检测。
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器(diode array detector,DAD) 可以获得吸光度、时间、波长的三维光谱色 谱图。可以做出任意时间下的吸光度-波长 曲线。 工作原理：令光线先通过样品流通池，然后 由一系列分光技术，使所有波长的光在接 收器上同时被检测。
结构：
荧光检测器
荧光检测器(fluorescence detector,FLD)灵敏度极高，最小 检出量可达10-14g，具有良好的选择性（具对称共轭体系 的分子），能够避免不发荧光的成分干扰。 工作原理 化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波 长长的特征辐射，当入射光停止照射时，特征辐射也很快 消失，这种辐射光线就是荧光。被化合物吸收的光称为激 发光，产生的荧光称为发射光（一般为可见光）。 在相对条件下，物质的荧光强度与该物质溶液的浓度成正 比（定量依据）。
色谱柱的日常维护： 每次开机时，流量要逐渐增强或降低，避免突然增 压或降压，使柱床受到冲击，产生空隙。 在使用缓冲溶液做流动相时，更换甲醇前，一定要 用水将盐冲洗干净，否则盐沉积可能导致色谱柱彻 底堵塞报废。 每次实验结束后，反相色谱操作方式要用纯甲醇或 乙腈冲洗色谱柱20min以上才能关机。 拆卸后的色谱柱两端用盲头螺丝拧紧，防止封存的 溶剂挥发。