第二节 液相色谱检测方法
液相色谱仪检定方法
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液相色谱仪检定－检定方法
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液相色谱仪检定－检定方法
有吸光值显示的检测器，改变波长可直接读出吸光值，其最大 最小吸光值对应的波长与标准溶液的波长之差为波长示值误差。
•换档误差只适用于使用积分仪和数据处理机时
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液相色谱仪检定－检定标准
4）整机性能检定标准
仪器的整机性能用定性定量测量重复性表示 ①定性测量重复性（6次测量）RSD6：不超过1.5% （保留时间 的偏差） ②定量测定重复性（6次测量）RSD6：不超过3.0% （峰面积 的偏差）
岛津液相色谱方法开发与应用
---液相色谱仪检定
岛津国际贸易（上海）有限公司
分析仪器事业部 分析中心
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液相色谱仪检定
一、液相色谱仪性能检测包括：
1.计量性能要求 1）输液系统 2）柱温箱 3）检测器 4）整机性能
线性范围
换档误差
4 整机：定性定量重复性
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
＋
－
－
＋
－
－
＋
＋
＋
注： ①“＋”表示应检定项目，“－”表示可不检项目 ②无梯度洗脱装置和无柱温箱的仪器，次项目可不检定 ③紫外－可见光、二极管阵列和荧光检测器检定此项目，示差折光检测器不检定此项目
液相色谱法ppt课件
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
经典液相色谱法 ppt课件
和薄层色谱。
ppt课件
3
1.2 吸附色谱法的依据
吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 平衡,存在一个吸附平衡常数 解附的动态
K=Cs/Cm
2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异
ppt课件 4
吸附机理
流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流
动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分 子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之， 溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。
SO3H CH CH2 CH
SO 3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H
SO3H
SO3H
ppt课件
SO3H
SO3H
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交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + ClR-SO3- Na+ + H+ + Cl-
ppt课件
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1.2 阴离子交换树脂
根据可交换的离子的不同
低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗 透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。
ppt课件 53
根据分离对象选择树脂交联度：
分离小分子物质（氨基酸） ——选择8%树脂为宜
分离分子量较大的物质（多肽）
——选择2－4%树脂为宜
保留：极性越小的组分保留越强
ppt课件
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3. 载体
作用：负载固定液 要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间
有较大的分子间作用力。
常用载体：硅胶 、硅藻土 、纤维素
ppt课件
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4. 固定液相与流动液相
液相色谱检测操作规程
文件编号： SC-SOP-00400 第 1 页共 1 页1. 目的：规范液相色谱检测操作2. 范围：适用于抗菌肽有效成分检测3. 职责：实验室人员对本操作规程的实施负责。
4. 内容：4.1 样品制备取300ul样品液加入到1.2ml甲醇中，摇匀浸提60min，然后3500rpm离心15min，取上清用0.22um的一次性过滤器过滤待用，然后将一次性插管置于样品瓶中，加入20ul滤液，盖上盖子。
4.2 流动相配制有机相：乙腈装于带盖玻璃瓶中，稍拧瓶盖，置于超声清洗机超声15min，去除气泡。
无机相：使用色谱级乙酸铵配制10mmol/L的乙酸铵溶液，用超纯水配制，装于带盖玻璃瓶中，稍拧瓶盖，置于超声清洗机超声15min，去除气泡。
水：装于带盖玻璃瓶中，稍拧瓶盖，置于超声清洗机超声15min，去除气泡。
4.3 仪器准备安装色谱柱：将色谱柱按照柱子的箭头指向安装，拧紧固定螺母开机：打开电脑，然后依次打开泵、进样器、柱温箱、检测器电源，电脑端连接仪器。
平衡基线：将泵的吸取头依次插入对应的有机、无机相瓶中，开启泵和进样器的排气，然后电脑端开启主控、柱温箱、泵，开始平衡基线，待基线呈现为直线时即可。
4.4 上样：将装有待检样品的样品瓶放入进样箱内，记录位置和对应样品瓶编号4.5 检测：设定好对应的方法文件，检测波长为210nm，柱温为30℃，设置流动相比例为有机相：无机相=35：65，流速为0.3ml/min，进样10ul。
4.6 结束：检测完成后，关闭泵，将无机泵吸取头取出置于准备好的水中，开启泵的排气，将有机和无机相的比例调整为50%，流速为1ml/L，开启泵，冲洗色谱柱半个小时以上，依次关闭检测器、柱温箱、进样器、泵、电脑，取出色谱柱，清理垃圾。
5. 注意事项5.1 注意所有进入仪器的液体必须超声除去气泡，非色谱级试剂必须使用0.22um的一次性过滤器过滤，水必须使用超纯水。
5.2 设备必须按照操作规程使用，禁止不熟悉的人员单独使用。
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
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选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
液相色谱法药物分析技术的使用方法
液相色谱法药物分析技术的使用方法液相色谱法（Liquid Chromatography，LC）是一种常用的药物分析技术，可以用于分离、鉴定和定量药物或其他化合物。
该技术具有高效、灵敏、选择性好等优点，被广泛应用于药物研究和制药行业。
本文将介绍液相色谱法药物分析技术的使用方法，包括样品准备、色谱柱选择、色谱条件优化等方面。
1. 样品准备在液相色谱法药物分析中，样品的准备非常关键。
通常，样品需要经过提取、纯化和浓缩等处理步骤。
提取可以采用溶剂提取、固相萃取或液液萃取等方法，根据药物的性质和样品的特点选择合适的提取方法。
纯化可以通过固相萃取柱等固相萃取方法进行，以去除样品中的干扰物。
最后，对样品进行适当的浓缩，使其达到液相色谱分析所需的浓度范围。
2. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱法药物分析中的核心部分，其选择直接影响到分离效果和定量结果的准确性。
在选择色谱柱时，需要考虑样品的性质、分离目标、色谱条件等因素。
常见的色谱柱类型包括反相色谱柱、离子交换色谱柱、凝胶过滤色谱柱等。
反相色谱柱适用于一般的药物分析，而离子交换色谱柱则适用于酸、碱性物质的分析。
根据实际需求进行选择，同时也需要注意色谱柱的耐用性和稳定性。
3. 色谱条件优化在液相色谱法药物分析过程中，色谱条件的优化对于分离效果和分析速度至关重要。
色谱条件包括流动相的选择、缓冲剂浓度、pH值、流速等因素。
对于药物分析来说，常见的流动相包括水、有机溶剂或其混合物。
根据药物的亲水性或疏水性进行选择。
同时，缓冲剂的浓度和pH值也需要根据药物的性质进行调整，以实现最佳的分离效果。
流速的选择一般考虑分离效果和分析时间之间的平衡，过快的流速可能导致分离不彻底，而过慢的流速则会延长分析时间。
4. 样品注射和柱温控制在液相色谱法中，样品注射的方式也会对分析结果产生影响。
常见的注射方式包括进样器自动进样、手动微量注射等。
对于样品浓度较高的情况，可以采用自动进样的方式，而对于样品浓度较低的情况，则需要选择手动微量注射。
液相色谱法2
3离子交换色谱法
基于离子交换树脂上可电离的离子与流 动相中具有相同电荷的溶质离子进行可 逆交换，依据这些离子对交换剂具有不 同的亲合力而将它们分离的。
阳离子交换 M++(Na+-O3S-树脂)(M+-O3S-树脂)+Na+ 阴离子交换 X-+(Cl-+R4N-树脂)(X-+ R4N -树脂)+Cl-
5积分仪－记录仪－计算机
峰高 峰面积 保留时间 参考保留时间
水峰
6标准混合溶液的配制
钙、镁、钾、钠混合标准溶液 Ca2+ 5ppm Mg2+ 10ppm K+ 5ppm Na2+ 10ppm
阴离子的测定
AS4A阴离子分离柱 阴离子抑制柱 电导检测器 淋洗液为 碳酸钠 碳酸氢钠的混合液 再生液为 硫酸 淋洗液流速 2ml/min 再生液压力为5 psi
1紫外光度检测器
被分析试样组分对特定波长紫外光的选 择性吸收,组分浓度与吸光度的关系遵守 比尔定律。
低压汞灯 透镜：将光源射来的光束变成平行光 遮光板：变成一对细小的平行光 测量池 参比池 紫外滤光片 双紫外光敏电阻
惠斯顿电桥 输出信号差测量进行检测
特点： 灵敏度高 对温度和流速不敏感，可梯度淋洗 结构简单
液变成低电导的水和碳酸。 基线值越低越好。 基线走直，才能测定试样。
1阳离子抑制柱原理
2阴离子抑制柱原理
4 检测器
1电导检测器 2脉冲安培检测器 3紫外可见检测器
4.1电导检测器
电导池有两个电极，它们与溶液 形成回路，产生电流，电流大， 电导值大，在稀溶液中，溶液的 浓度和电导值成正比。
K=cs/cm=k Vs/Vm
分析液相色谱仪检定方法和注意事项
分析液相色谱仪检定方法和注意事项摘要液相色谱仪是高精度的仪器之一，在物质分离分析中所起的作用日渐重要，针对该仪器的检定，国家颁布了统一的检定标准，检定过程需要严格按照该标准来执行。
本文主要介绍了液相色谱仪的工作原理及其组成，并简单介绍了几个常见项目的检定方法和在检定过程中需要注意的一些问题，为检定人员提供一定的参考。
关键词液相色谱仪；检定；液相色谱法液相色谱仪是广泛应用在研究所，实验室等场所、对所研究样品进行分离分析的常规仪器之一。
它的优点主要有：1）可以在短时间内把样品分析出来；2）对于所分析样品没有太多要求，只要能制成液体即可；3）不需要太多的样品就可以分析出来；4）对于各组分含量很少的样品也能分析出来。
以上优点决定了该仪器在生物、医药、食品、材料等各领域研究工作的广泛应用。
1 液相色谱仪的原理高压泵利用高压把流动相压进系统中，然后样品溶液从进入到流动相中，并跟随流动相运动，最终进入色谱柱中，由于样品溶液的各个组成物质具有不同的性质，在色谱柱中运动时会有一定的差异，经过一段时间的运动以后，运动速度差异会变得越来越大，这样就被分成多个部分分别从色谱柱中流出，这样在检测器中就记录下了这些样品组分的浓度，然后以图谱的形式呈现出来。
2 液相色谱仪的组成液相色谱仪主要由加入样品系统、输送样品系统、分离样品系统、检测结果系统和结果分析处理系统组成。
2.1样品加入系统一般是用安装有隔膜的注射器或者是利用高压来加进样品，为了提高所分析样品的重复性，要在加样时注意使每次加入的样品量保持相同。
2.2样品输送系统高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分组成了输送样品系统。
高压泵的一般压强为14.7MPa～44MPa，如此高的压强可以使待分析样品液体以相当大的速度通过层析柱，较大速度可降低样品在层析柱中向四周扩散。
贮存器和密度梯度仪的作用是使样品流动相随着所用固定相和样品的变化而变化，具体包括改变洗脱液的吸水性、阴阳离子浓度、PH值，这样就可使各种样品成分最终都可以实现有效的分离，增强分离的效果。
液相色谱法
（2）平面色谱法（Planar Chromatography）
按平面色谱材料不同可分为: 薄 层 色 谱 法 （ Thin Layer
相之间发生反复多次的分配过程。 色谱分离过程是不同物质分子在相对运动的两相之间，多次
分配平衡而得到分离的过程。
2.分配系数（distribution coefficient）K
在一定的温度和压力下，某个组分在固定相（S）与流 动相（m）中达到分配平衡时的浓度之比，称为该组分 的分配系数，即，K = Cs/Cm 。
按流动相分
按机理分
气相色谱（GC） 液相色谱（LC） 超临界流体色谱（SFC） 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 亲和色谱
三、色谱分离过程
（一）、色谱法的基本步骤
1、制备成色谱床：根据试样分析目的选择固定相，按操作 形式的要求制备成色谱床（装填成色谱柱，或涂铺到薄层 板上等）。 2、进样（或点样）。将处理好的样品以一定方式加到固定 相的一端。 3、洗脱或展开。将流动相以一定速率载运样品连续通过固 定相，使样品各组分在两相相对运动中彼此分离。 4、收集从色谱床上分离的各组分，进行检测（定性、定量 分析）。
气相色谱仪
气相色谱仪结构示意图
薄层色谱法
1956年出现薄层色谱法。
薄层色谱法
凝胶过滤色谱法
1959年出现凝胶过滤色谱法。
高效液相色谱法
1968年前后产生高效液相色谱法。
高效液相色谱仪
超临界流体色谱法(Supercritical Fluid，SCF)
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
【精品文档】液相色谱仪（UV）检定操作规程
10min，计算基线噪声。
记录基线 60min，计算基线漂移。
3.4.3. 结果计算：
Nd=KB 式中：
Nd--检测器基线噪声； K--衰减倍数；
B--测得的基线峰-峰高对应的记录仪标度，AU
基线漂移用 1h 内基线偏离原点的值（AU/h）表示。
3.4.4. 结果判断： 基线漂移≤5×10-3(Au/h)
1.3. 仪器操作及环境条件：应符合相应仪器的操作及维护规程(SOP)。
2. 检定项目和技术要求
2.1. 泵流量设定值误差应 Ss≤±2%；流量稳定性误差应 SR≤±2%。 2.2. 柱温箱温度设定值误差 ΔTs 应不超过±2.0℃；柱温箱温度稳定性应不超过 1.0℃。
2.3. 波长示值误差应＜±2nm； 波长重复性应优于 1nm。
3.1.3. 结果计算 按下列公式计算 SS 和 SR： Fm=（W2-W1）/（P.t） SS=（Fm-FS）/FS×100%
SR=(Fmax-F min)/F×100% W2 为容量瓶+流动相的重量(g) W1 为容量瓶的重量 P 为实验条件下的流动相密度(g/cm3) t 为收集流动相的时间(min)P Fm 流量实测值(m l/m in) FS 流量设定值 Fmin 同一组测量中流量最小值 Fmax 同一组测量中流量最大值 F 为同一组测量中流量的算术平均值
2.4. 定性测量重复性误差(5 次定量环进样)应 RSD≤1.5%。
2.5. 定量测量重复性误差(5 次定量环进样)应 RSD≤1.5%。
2.6. 基线漂移应≤5×10-3(Au/h)，基线噪声应≤5×10-4Au。
2.7. 最小检测浓度应不超过 4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
2.8. 梯度误差 Gc 应不超过±3%（无梯度装置不进行此项检定）。
液相色谱仪检定方法及注意事项
液相色谱仪检定方法及注意事项摘要：本文对液相色谱仪检定方法及检定中出现的问题，结合自己的工作经验进行了探讨。
关键词：液相色谱仪 检定1、概述液相色谱仪因分离效率高；应用范围广；分析速度快；样品用量少；灵敏度高等特点，在送药、食品、环境、材料等领域有了广泛的应用，成为各类研究室、实验室极为重要的仪器设备。
本文依据JJG705-2002《液相色谱仪》检定规程，以紫外—可见光检测器为例，结合实际工作对主要检定项目泵流量、柱箱温度、基线噪声、基线漂移、最小检测浓度、定性定量重复性的检定及检定中的注意事项说几点看法。
2、检定方法按规程要求设定流量、启动仪器，待压力稳定后在规定时间内收集流动相，同时用秒表计时，出口处用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，在天平上称重，重复测量3次，则流量设定值误差SS 和流量稳定性误差SR ，公式如下：%100/)(⨯-=-S S S F F m F S%100/)(min ⨯-=--m S F F x Fma S 式中：F m -F m =（W 2-W 1）/（e t ·t ），流量实测值，ml/min ； W 2-容量瓶+流动相的质量，g ；W 1-容量瓶的质量，g ；e 1-实验温度下流动相的密度,g/cm 3；t-收集流动相的时间，min ；min /，ml F m 值同一组测量的算术平均--；Fs 流量设定值，ml/min ；Fmax-同一组测量中流量最大值，ml/min ；Fmin-同一组测量中流量最小值，ml/min ；2.2注意事项2.2.1收集流相和计时由一个人完成，减少计时误差；因甲醇容易挥发，收集时用封口胶密封容量瓶瓶口，收集完一瓶后立刻称量，收集的流动相在换算成体积后保留小数点后三位，最后结果保留小数点后一位。
2.2.2如果实际流速低于设定值，清洗或更换单向阀，过滤头；如果流速过高，检查流速补偿和压缩补偿调节是否失灵，如果流量不稳，检查泵头内是否聚集气泡，打开放空阀，让泵在高流速下运行，排除报泡；检查泵头是否松动，拧紧泵头固定螺丝，检查输液管路漏液或部分堵塞，需逐段管路进行排除。
紫外—可见光检测器线性范围的检定
图4－34内梯度洗脱装置之二
(2)色谱柱
色谱分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部分， 其中色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件。因为如果没有 一根高分离效能的色谱柱，则性能良好的高压泵、高灵敏 度的检测器和梯度洗脱装置的应用都将失去意义。
高效液相色谱法中最常用的色谱柱是由不锈钢合金材 料制成的，当压力低于6.9×103KPa(70Kg/cm2)，也可采用 厚壁玻璃管。一根好的色谱柱应能耐高压，管径均匀，特 别是内壁应抛光为镜面。但由于不锈钢柱管不易加工，所 以也有改用不锈钢管内壁涂衬一层玻璃或聚四氟乙烯以达 到上述目的。
往复式柱塞泵的优点是泵的液腔体积小（约 1/3~1/2毫升），输液连续，输送液体的量不受限制，因此，十 分适合于梯度洗脱；而且泵的液腔清洗方便，更换溶剂非常容 易。缺点是随柱塞的往复运动而有明显的压力脉动，因此液流 不稳定，易引起基线噪声。克服的方法是外加压力阻滞器，使 液流平稳。
图4－30往复式柱塞泵
光源通常采用低压汞灯。由低压汞灯H发出的光线经 过透镜L1聚焦为平行光，通过遮光板W后被分成一对细小 的平行光束，分别通过透镜L2、L3到达样品池C1和参比池 C2，当样品自色谱柱分离后流入样品池时，由于样品对紫 外光的吸收，使样品光路与参比光路之间的光强产生差异。 两束强度不同的光分别经滤光片F1、F2除掉不需要的其它 波长的非单色光后照射于两个配对的光电管，转换为电信 号，其差值经放大后即可检测。为了减小色谱峰的扩张， 检测池的体积应该小一些，目前标准的紫外吸收检测器的 检测池是长10mm，直径1mm，池体积8μ l。其结构常采用H 型或Z型，如图4－36所示，而以H型结构更为合理。
高效液相色谱仪的基本组件已如上述，其中最重要的 工作单元是高压泵、色谱柱、检测器和数据处理系统。
18章高效液相色谱法
六、反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子（或是称对离子） 生成不带电荷的中性离子对，从而增加溶质与非极性固 定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果， 适用于分离可离子化或离子型的化合物。 1、离子对模型
试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子 生成不荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生 保留。
第四节 高效液相色谱分析方法
一、定性和定量分析方法
1、定性方法分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。 2、定量方法常用外标法和内标法进行。 3、主成分自身对照法：
不加校正因子主成分自身对照法： 加校正因子主成分自身对照法： 二、高效液相色谱分离方法的选择 分离模式选择主要依据试样的性质和各种模式的分离 机制。试样的性质包括相对分子量、化学结构、极性和溶 解度等。
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长;
（2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同 的色谱特性。
（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
2、键合相的特点
高效液相色谱法的检测器要求：灵敏度高、噪声 低、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1、紫外检测器简介： 灵敏度较高、噪声低、线性范围宽，对流速 和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。 工作原理：是朗伯比尔定律，即组分的浓度与吸 光度成正比。 2、紫外检测器分类：
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进样系统
进样系统通常由手动六通进样阀或自动进 样器组成。可实现取样、进样两个目的。 直接注射器进样 进样技术｛ 停留进样 阀进样：装有定量管
分离系统
分离系统包括保护柱、分析柱及柱恒温箱。是色 谱仪的核心部分。 保护柱：保护分析柱的作用。应定期清洗或弃掉。 分析柱：通常为优质不锈钢制成，内径均匀，抛 光，五轴向沟槽。 常用色谱柱内径4.6mm，长20~25cm，填料粒度 通常为3~10µ m。
常见的商品牌号色谱柱
分离类型 填料 Hypersil CN, 5μ m Hypersil NH2, 5μ m Zorbax NH2, 5μ m Hypersil ODS-2(C18),5μ m Hypersil C18-BDS, 3 μ m Kromasil C18, 5 μ m 规格(柱长/内径,mm） 250×4.6 250×4.6 250×4.6 250×4.6 150×4.6 250×4.6
色谱柱的日常维护： 每次开机时，流量要逐渐增强或降低，避免突然增 压或降压，使柱床受到冲击，产生空隙。 在使用缓冲溶液做流动相时，更换甲醇前，一定要 用水将盐冲洗干净，否则盐沉积可能导致色谱柱彻 底堵塞报废。 每次实验结束后，反相色谱操作方式要用纯甲醇或 乙腈冲洗色谱柱20min以上才能关机。 拆卸后的色谱柱两端用盲头螺丝拧紧，防止封存的规格 紫外(UV) 荧光(FLD) 专用 能 105 10-14 无 低 荧光度 电化学(ECh) 蒸发光散射 （ELSD) 通用 不能 105 10-8 有 2% 电导率， µs/cm 通用 能 106 10-9 无 低 光散射
类型 专用 梯度洗脱 能 104 线性范围 10-11 最小检出量(g) 对流速敏感性 无 对温度敏感性 低 信号单位 吸光度，A
结构 蒸发光散射检测器由雾化部件、流动相蒸发部件、 目标化合物检测系统三部分组成。
使用及注意事项： 操作只涉及两个参数，雾化载气流压力和蒸 发器温度。 雾化载气流压力影响雾化器中液滴的形成， 信噪比随压力升高而升高。 检测灵敏度随蒸发器温度升高而加大。 流动相蒸发趋向完全，信噪比上升。 工作时必需备有氮气发生器，空气压缩机等 供气源，且必须在装有排风设备的屋内使用。
正相柱
反相柱
检测系统
检测系统由独立的检测器或附属部件构成。功能 是将物理或化学特性转变为可处理的电信号。 常用检测器主要有： 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 电化学检测器 质谱检测器 蒸发光散射检测器
紫外-可见光检测器
紫可见光检测器（ultraviolet-visible detector,UV-VIS）又称紫外 检测器，是液相色谱仪应用最广泛的检测器，既可测 190~350nm光谱范围的紫外光吸收变化，又可向350~900nm 光谱范围延伸。 特点： 灵敏度高：最小检出量可达10-12g。 噪声低，对流动相基本无相应。 属于选择性检测器，对无紫外吸收的物质五相应。 属于非破坏性检测器，可用于制备色谱或与其他检测器联用， 结构简单，操作方便，便于维修。
高效液相色谱仪器及操作
HPLC由输液系统、进样系统、分离系统、 检测系统和数据处理系统组成。
输液系统
输液系统是给分离系统提供稳定的能将混合组分分 离的高压液体。 贮液器：玻璃或聚四氟乙烯衬里的塑料容器，容积 0.5~2L。 置于贮液器底部的输液导管需安装孔径10µ m的不锈 钢质或铝质或聚四氟乙烯的过滤头。 流动相在转入贮液器前必须过滤（0.45µ m的微孔膜） 和脱气（在线脱气和离线脱气）。 脱气装置：在线脱气装置装有加热器、温度调节器 和磁力搅拌器。
高效液相色谱仪的日常维护
对流动相的要求： 流动相必须经过0.45µ m的滤膜过滤并脱气后才能上 机使用。 在分析柱前要加装保护柱。 注意用超声波清洗器定期在稀硝酸或甲醇中清洗过 滤头。 进样系统的维护： 使用指定的进样器，防止进样器针头划伤阀体。 在农药残留分析周期内，不要进行有干扰的常量分 析。
工作原理： 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光辐射通过物质溶 液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光 物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。
A=εbc
A为吸光度；ε为样品的摩尔吸光系数；b为光程长；c为样品 的浓度。
待测农药对紫外光吸收的特性取决于农药的分子结 构（存在生色团、助色团（羟基、胺基等））。 在选择检测波长时，通常选择该农药分子的最大吸 收波长，有时也综合考虑流动相杂质的影响。
结构 荧光检测器包括激发光源、选择激发波长用 的单色器，流通池、选择发射波长用的单色 器及光电检测器。 使用注意事项： 流通池容易被污染，必要时可以用铬酸洗液 浸泡过夜。 常用于荧光检测器检测的农药品种有苯并咪 唑类农药、甲基吡恶磷、多菌灵、涕必灵等。
电化学检测器
电化学检测器（electrochemical detector, ECh）是 根据点化学原理和物质的电化学性质进行检测的。 属于通用型检测器，对那些没有紫外吸收或不能 发出荧光但具有电活性的农药，可采用电化学检 测法。主要有 安培检测器：以测量电解电流的大小为基础。 电导检测器：以测量液体的电阻变化为根据。
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器(diode array detector,DAD) 可以获得吸光度、时间、波长的三维光谱色 谱图。可以做出任意时间下的吸光度-波长 曲线。 工作原理：令光线先通过样品流通池，然后 由一系列分光技术，使所有波长的光在接 收器上同时被检测。
结构：
荧光检测器
荧光检测器(fluorescence detector,FLD)灵敏度极高，最小 检出量可达10-14g，具有良好的选择性（具对称共轭体系 的分子），能够避免不发荧光的成分干扰。 工作原理 化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波 长长的特征辐射，当入射光停止照射时，特征辐射也很快 消失，这种辐射光线就是荧光。被化合物吸收的光称为激 发光，产生的荧光称为发射光（一般为可见光）。 在相对条件下，物质的荧光强度与该物质溶液的浓度成正 比（定量依据）。
高压输液泵： 多用不锈钢、聚四氟乙烯材料制造，泵的活塞多采 用石英 杆制成。 往复式柱塞泵 恒流泵｛ 高压输液泵｛ 注射泵 恒压泵：气动放大泵 液缸内不能进入气泡或进入后要及时排出。柱塞密封垫是易 损件，泵漏液时必须更换。 梯度洗脱装置： 梯度洗脱就是将两种或两种以上的不同极性的容易进行混合， 作为流动相使用。 低压洗脱：泵前混合 梯度洗脱｛ 高压洗脱：泵后混合
蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器（evaporative light-scatter detector,ELSD） 标志着高效液相色谱仪高灵敏度、通用型质量检测器的诞生。 工作原理 当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会发生光散射现象。 在一定的角度测得的光散射强度与烟雾粒子大小和数量成正 比。理论上可以检测挥发性低于流动相的所有化合物。 经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，利用高速气流 喷成一薄雾，雾化为微小液滴的流动相进入加热的蒸发器蒸 发，不挥发的目标化合物微粒化后进入光路发生光散射，散 射光被光电倍增管捕获检测。
4.2 高效液相色谱检测方法
HPLC与GC的区别 液相色谱仪器及操作
气相色谱与液相色谱的比较
类别 流动相 固定相 气相色谱 气体(He,N2,H2) 多（数百种） 液相色谱 液体 较少（十几种）
分析对象
检测技术 制备分离
可挥发且热稳定，沸点 不受样品挥发性和稳定 <500℃ 性的限制 多（FID，ECD，NPD， 少（UV-Vis，荧光， FPD，MS） 电化学，MS） 烦琐 简便
结构： 紫外检测器由光源、分光系统、流通池和检测系统 四大部分组成。 光源：由氘灯（195~400nm）和钨灯 （400~850nm）组成。 分光系统：包括聚光镜、狭缝机构和单色器（光 栅）。 使用注意事项： 日常分析结束后，要用甲醇或乙腈清洗色谱柱和检 测室20min以上。 严防检测器出口堵塞，导致压力过高，石英测量池 爆裂。