高效液相色谱法定性定量分析ppt精选课件
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【精品课件】高效液相色谱定性定量分析方法
• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
高效液相色谱法定性定量分析讲解
谢谢大家!!!
定性分析
常用的液相色谱定性方法有： 1. 利用已知标准样品定性 利用标淮样品对未知化合物定性是最常 用的液相色谱定性方法。由于每一种化合物 在特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱 、桂温等相同），其保留值具有特征性，因 此可以利用保留值进行定性。
2．利用检测器的选择性定性 同一种检测器对不同种类的化合物的响
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器 。全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外 光谱图提供一些有价值的定性信息。
传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值 即最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞 留，然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组 分的紫外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方 法处理。对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品 是否相同。对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以 通过对照标准谱图的方法来识别化合物。
固定相的种类：
1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表示差
）
流动相：
一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、 与检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性 的特征。
选择流动相要考虑的因素：
1.流动相应不改变填料的任何性质； 2.纯度； 3.必须与检测其匹配； 4.粘度要低； 5.对样品的溶解度要适宜； 6.样品易于回收。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵； 2. 流动相不含有任何腐蚀性物质； 3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完； 4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力； 5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱法 (HPLC)ppt课件
Chromatography)
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
31
精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
总之，HPLC与经典LC相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。HPLC的高重现性和 连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具 有较高的准确性和精密度。
经典LC的特点：简精便选课件，PPT填料一次使用。 9
高效液相色谱仪基本装置
进样阀 色谱柱
检测器
流动相 高压泵
● 通用检测器与选择型检测器
● 浓度型检测器和质量精选型课件检PPT测器
20
检测器的线性、灵敏度和柱外效应三个基本特性直
接影响色谱定量分析的准确度、精密度和再现性。
◆ 检测器的线性范围
大部分厂商都声称它们的检测器在一定的浓度范围内是线性
响应。实际上检测器的线性方程可表示为：y = a c , 只有在三 个数量级的浓度范围内满足0.98 1.02的线性响应的检测器 才是线性的。
高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电色谱(CEC) 、微柱液相色
谱(μ- HPLC) 、固相萃取等系统上, 成功地应用于生命科学、药
物学、环境科学等领域的分精离选分课件析PP。T
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精选课件PPT
何为无死 体积柱头 连接？
无限直径 效应（无 限直径 柱）？
32
柱填料
硅胶和硅基仍是目前最广泛应用的液相色谱柱填料。 此外还有高分子多孔微球、高疏水表面的多孔碳、无 机金属氧化物等。
tr nrti
● 基线校正和重叠峰的分离
在色谱分析中，经常会遇到基线漂移和色谱峰不能
完全分离的情况。通常采用谷—谷规则或预设基线漂
移值参数来解决
精选课件PPT
25
色谱仪自动定性和定量分析
定量计算是把各种计算公式编制成应用软件存入计算机，通 过键盘来选择所需方法。微处理机在定量计算时, 一般通过保留 值来识别峰。但由于各种因素的影响, 在重复多次分析中, 保留 值会有一定的变化, 可采用下述两种方法确定保留值的变化范围。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
Βιβλιοθήκη 高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
高效液相色谱法对两种氨基甲酸酯类农药的定性定量分析
实验五高效液相色谱法对两种氨基甲酸酯类农药的定性和定量分析1 实验目的掌握高效液相色谱法的基本原理方法；熟悉液相色谱仪基本结构及使用方法；掌握对两种氨基甲酸酯类农药的定性和定量分析的实验步骤及注意事项。
2 实验原理2.1方法原理色谱分离的基本原理是在外力作用的条件下，含有样品的流动相通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。
样品中各组分在两相之中进行不同程度的作用。
与固定相作用强的组分随流动相流出的速度慢，反之与固定相作用弱的组分随流动相流出的速度快。
高校液相色谱是以溶剂为流动相的色谱方法，具有高效、高速、高灵敏度的优点。
由于流出速度存在差异即各组分保留时间不同，使得混合组分最终形成各个单组分的“带”或“区”，对依次流出的各个单组分物质可分别进行定性、定量分析。
样品中各组分在固定相的分离机理有许多种，包括不同组分在固定相的吸附作用不同；不同组分在固定相上的溶解能力不同；不同组分在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；不同尺寸分子在固定相上的渗透作用不同。
定性：通过保留时间对目标物进行定性分析；定量：运用公式：C / A=C' / A'；其中C为待测样目标物的浓度；A为待测样目标物的峰面积；C'为目标物混标的浓度；A'为目标物混标的峰面积。
2.2仪器原理高效液相色谱仪包含五部分结构：高压输液装置、进样系统、分离系统、检测系统和工作站软件，还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置[1]。
高压输液装置：包含贮液器、脱气、高压输液泵三方面。
通过超声波脱气或真空加热脱气。
溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
相关主题
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定性分析
常用的液相色谱定性方法有： 1. 1. 利用已知标准样品定性
利用标淮样品对未知化合物定性是最常 用的液相色谱定性方法。由于每一种化合物 在特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱 、桂温等相同），其保留值具有特征性，因 此可以利用保留值进行定性。
2．利用检测器的选择性定性
同一种检测器对不同种类的化合物的响 应值是不同的，而不同的检测器对同一种化 合物的响应也是不同的。所以当某一被测化 合物同时被两种或两种以上检测器检测时， 两个或几个检测器对被测化合物的检测灵敏 度比值是与被测化合物的性质密切相关的， 可以用来对被测化合物进行定性分析，这就 是双检测器定件体系的基本原理。
检测器
检测器是HPLC系统的三大关键部 件之一，作用是把洗脱液中的组分的量 转化为电信号。HPLC的检测器要求是 灵敏度高，噪音低，线性范围宽，重复 性好，适用范围广等特点。
数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计 算机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更 加迅速，简便，准确，精密和自动化，现在 已经可以在互联网上远程处理数据，目前计 算机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥 发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不 同极性的有机化合物；生物活性物质和多种 天然产物；合成的和天然的高分子化合物等 。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物 、生物化工产品及环境污染物等，约占全部 有机化合物的80％。其余20％的有机化合 物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等 分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分 析。
进样器
进样器： 目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。 对进样装置的要求：
密封性好，死体积小， 重复性好，保证中心进样， 进样时对色谱系统的压力、 流量影响小。 进样方式可分为：
隔膜进样、停流进样、阀进 样、自动进样。目前应用做多的 是阀进样和自动进样。
色谱柱
色谱柱的要求：
柱效高、选择性好，分析 速度快等。市售的用于HPLC的 各种微粒填料好多孔硅胶以及以 硅胶为基质的键合相、氧化铝、 有机聚合物微球(包括离子交换 树脂)、多孔碳等，其粒度一般 为3，5，7，10μm等，柱效理 论值可达5～16万/米。对于一 般的分析只需5000塔板数的柱 效;对于同系物分析，只要500 即可;对于较难的分离物质对则 可采用高达2万的柱子，因此一 般10～30CM左右的柱长就能 满足复杂混合物分析的需要。
高效液相色谱法（HPLC） 及定性定量分析
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提纲
❖一﹑HPLC系统简介 ❖二﹑HPLC中的固定相和流动相 ❖三﹑应用范围 ❖四﹑定量定性分析
一、HPLC系统
HPLC系统
输进
色
检
数据
液样
谱
测
记录 及处泵器柱器来自理HPLC示意图
输液泵
输液泵： 输液泵是HPLC系统中的重要部件之一，
泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和 分析结果的可靠性。
HPLC的固定相和流动相
固定相：即所说的基质或者单体，可以 是陶瓷的无机物基质，也可以是有机聚合物 基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝，在 溶剂中不容易膨胀，有机聚合物基质主要是 交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有 机聚合物刚性小、易被压缩，溶剂或溶质容 易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结 果减少传质，最终使柱效降低。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵； 2. 流动相不含有任何腐蚀性物质； 3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完； 4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力； 5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
固定相的种类： 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 4. 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表
示差）
流动相： 一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、
与检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性 的特征。 选择流动相要考虑的因素： 1.流动相应不改变填料的任何性质； 2.纯度； 3.必须与检测其匹配； 4.粘度要低； 5.对样品的溶解度要适宜； 6.样品易于回收。
定量分析
1.归一化法 归一化法要求所有组分都能分离并有响
应。由于液相色谱所用检测器为选择性检测 器，对很多组分没有响应，因此液相色谱法 较少使则归一化法。 2.外标法
外标法是以待测组分纯品配制标准试样 和待测试样同时作色谱分析来进行比较而定 量的，可分为标准曲线法和直接比较法。
3.内标法
内标法是比较精确的一种定量方法。它 是将已知量的参比物（内标物）加到已知量 的试样中．那么试样中参比物的浓度为已知 ；在进行色谱测定之后，待测组分峰面积和 参比物峰面积之比应该等于待测组分的质量 与参比物质量之比，求出待测组分的质量， 进而求出待测组分的含量。
3．利用紫外检测器全波长扫描功能定性
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器 。全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外 光谱图提供一些有价值的定性信息。
传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值 即最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞 留，然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组 分的紫外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方 法处理。对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品 是否相同。对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以 通过对照标准谱图的方法来识别化合物。