第11章免疫分析 PPT

ELISA）
需要了解的基本概念
▪ 酶免疫测定（Enzyme Immunoassay, EIA)
✓ 均相酶免测定 对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物 测定
✓ 异相酶免测定 需经过结合的标记物和游离的标记物的分离 才能测定. 分离的方法主要通过固相载体，故此法称为固相 酶免疫测定ELISA 。
▪ ELISA的测定模式 :
全自动酶联免疫系统集加样品、加试剂、孵育 、震荡、洗板、读数、数据处理7大功能于一体。
二、酶免疫分析仪的类型、工作原理及 基本结构
微孔板固相酶免疫测定仪器(酶标仪) 半自动微孔板ELISA分析仪 全自动微孔板ELISA分析仪 管式固相酶免疫测定仪器 小珠固相酶免疫测定仪器 磁微粒固相酶免疫测定仪器等
1、微孔板固相酶免疫测定仪器
有单通道和多通道两种类型 工作原理与主要结构和光电比色计相同 不同之处在于：
比色液的容器是塑料微孔板 以垂直光束通过待测液 通常使用光密度OD来表示吸光度
2、半自动微孔板式ELISA分析仪
在酶标仪的基础上再配置:
加液器 温育器 洗板机 测读仪
测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。
✓ 双抗体夹心法 ✓ 间接法 ✓ 竞争法
双抗体夹心法（三明治法）原理
待测物
标记抗体
固相支持物表面
包被抗体
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
Hook效应
线性范围
待测物浓度（X）
竞争法的原理
待测物 标记抗原
固相支持物表面
包被抗体
竞争法的剂量--反应关系曲线
信号强度（ Y ）
线性范围
待测物浓度（ X ）
第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃 纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体 则通过膜滤出。
以后的反应在膜上进行，标记酶为ALP，底物为4甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。
6、磁微粒固相酶免疫测定仪
瑞士出品的分析系统由分光光度测读仪、磁铁板和 试剂组成：
试剂包括：
抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体
3、全自动微孔板式ELISA分析仪
自动化酶免疫分析系统由:
加样系统 温育系统 洗板系统 判读系统 机械臂系统 液路动力系统 软件控制系统等组成
温育箱 反应板 迭式存储器
X-Y头架
样品架
50根 装
50×3
4根独立 上下吸 移管
检 测 光 纤
反应板
反应板 夹具
清 洗 装 置
供水箱 废水箱
稳 定：
只要避免人为操作错误， 可连续数年良好工作。
准 确：
不存在交叉感染。反应振荡， 确保检测 准确。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
高 速：
加注、读板速度快
扩 展 性：
软件可升级，样本量增加，可联机使用
用户做主更多：
开放式试剂 WINDOW操作系统 中/英/日自选操作界面 自定义编程 自动/自定义时间表 无限存档
4、管式固相酶免疫测定仪
辣根过氧化物酶的色原底物
HRP最常用的色原底物有:
邻苯二胺(OPD)、2，2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑磺酸6)[ABTS](杂环吖嗪)
四甲基联苯胺(TMB) 4-氨基安替比林：苯酚耦联底物对
OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的 作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’-二氨基偶 氮苯(DAB)。在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范 围的最大吸收，当pH值降为1.0时，最大吸收波长移动至 492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深。因而常用强 酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致 突变作用。
三、酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
（一）评价指标和方法
1．滤光片波长精度检查及其峰值测定 2．灵敏度和准确度 3．通道差与孔间差检测 4．零点飘移 5．精密度评价 6．线性测定 7．双波长评价
重点是光学部分 1．滤光片波长精度检查 2．通道差与孔间差检测
四、酶免疫分析仪的临床应用
１．病原体及其抗体的检测 2．各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等 3．肿瘤标志物 4．多种激素 5．药物和毒品
1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配 套试剂
用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗 原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物 ABTS
测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点 定标
测定的精密度CV在3%左右
5、微粒固相酶免疫测定仪
美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗 粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在 微粒上。
标记抗体 （二抗）
待测抗 体
间接法原理
包被体
包被抗 原
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
标记抗原
俘获法原理
包被体
待测抗体
俘获抗体 （二抗）
标记抗原 待测抗体
双抗原夹心法原理
包被体
包被抗原
我们把采用酶标的方法测定物质含量的设备称为 酶标仪。
一般简单的酶标仪只有读数、数据处理的功能， 还需要配置孵育箱，洗板机，人工操作步骤繁琐 。
第11章免疫分析
第一节 酶免疫分析仪
一、酶免疫分析技术的分类：
酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)
根据是否需要分离结合与游离的酶标记物，可分为: 酶扩大免疫测定
均相酶免疫测定
非均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定 液相酶免疫法
固相酶免疫法
(酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay，
特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm）
FITC结合的特异抗体或抗原
碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原
什么样的反应
底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯
反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁 吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反 应液呈粉红色。
磁颗粒ELISA是将两株单抗分别标记酶和异硫氰 酸荧光素(FITC)，另将一抗FITC抗体经化学反应 与磁颗粒偶联，制成可磁化固相通用分离剂。测 定时将样品和两种标记单抗加至试管中温育，然 后加入可磁化抗FITC颗粒分离剂，生成夹心免疫 复合物，洗涤，加酶底物显色。
检测时间:以乙肝两对半（立可读）为例
仪器操作各单元如下（满板）
加样品时间：6-7分钟；9-10分钟（使用液面传感器） 加酶时间： 4分46秒(洗5遍，不浸泡) 加两种显色剂A、B共： 5分30秒 加终止液： 2分42秒 读板时间： 2分58秒
优势
自动化程度高：
前后处理一体化设计，减少人与样品的 接触机会，降低感染。各种自动安全检 测能。