7 胰蛋白酶活力的测定
酶活力测定方法
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
蛋白酶活性测定
1.5.2.2 蛋白酶活性测定采用福林酚−试剂法[3]测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性，其原理是：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯醋酸（TCA ）氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这些氨基酸可与福林酚试剂反应呈蓝色，用756分光光度计在波长680nm 测定。
蛋白酶活性的定义：1克食糜或组织在30℃，pH7.0[4]的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。
测定步骤如下：将2%的酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴锅中预热3-5min ，每个样品取两个重复（每个酶液样品设一个空白对照），各取1mL 酶液注入试管中，在30℃恒温水浴锅中预热1-2min ，加入2%的酪蛋白1mL ，准确反应10min ，加0.4M 三氯醋酸2mL 终止反应，在水浴锅中静置10min 后过滤，取滤液0.5mL 加0.4M 碳酸钠溶液2.5mL ，并加入显色剂福林试剂0.5mL 摇匀，在30℃恒温水浴中显色20min ，取出放在756分光光度计，680nm 的波长下测定吸光度（OD ）。
蛋白酶活性计算公式：4—反应总体积(mL) 10—反应时间(min) K —标准曲线获取 N —酶液稀释倍数 M —样品质量(g)A. Setting up the Protease Assay1. Pre-heat 0.5% Casein solution In a water-bath at 30 o C for 5min2. Follow the following table蛋白酶酶活性(U/g) =4×K×OD×N 10×M3.4.Follow the following table to determine sample blank。
胰蛋白酶
胰蛋白酶简介一、介绍胰蛋白酶（C6H15O12P3）为蛋白酶的一种。
在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。
在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。
作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。
是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量23800，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。
除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。
另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。
胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。
胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。
中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。
由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。
白色或米黄色结晶性粉末。
溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。
分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。
pH>9.0不可逆失活。
Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。
临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。
胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。
酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。
1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。
1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。
胰蛋白酶比活力测定的实验操作
胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。
测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。
下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。
实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。
2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。
3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。
4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。
5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。
6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。
实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。
用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。
2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。
黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。
通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。
数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。
2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。
注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。
2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。
3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。
胰蛋白酶 药典标准
胰蛋白酶药典标准胰蛋白酶是一种消化酶，被广泛应用于临床医学中治疗消化系统疾病，如胰腺炎、胰腺癌、胃肠手术后等。
药典标准是评定药品质量的重要参考，下面将详细介绍胰蛋白酶的药典标准。
胰蛋白酶的药典标准主要包括国际药典（比如美国药典、欧洲药典）和中国药典两个方面。
这些药典标准规定了胰蛋白酶的质量要求、生产工艺以及检测方法等方面。
以下是对其中几个重要药典标准的介绍：1.国际药典：美国药典和欧洲药典规定了胰蛋白酶的质量要求。
例如，美国药典规定了胰蛋白酶的单位活性应满足特定标准，比如1 USP单位相当于3.6微克胰蛋白酶，并规定了对其它微生物污染的限制。
2.中国药典：中国药典对胰蛋白酶的质量要求与国际药典接近，但有些细节的要求有所不同。
例如，中国药典规定了胰蛋白酶的酶活力不得低于10,000 USP单位/g，并规定了胰蛋白酶的酶活性测定方法。
药典标准还要求生产工艺和质量控制方面的要求。
生产工艺包括胰蛋白酶的提取、纯化、浓缩和干燥等，要求按照良好的制造规范进行操作。
质量控制方面要求对原辅材料进行严格检测，确保其质量符合标准，并要求对成品进行全面检测，确保其有效成分含量符合规定。
胰蛋白酶的标准化是确保其质量和疗效的关键。
通过遵循药典标准，可以保证不同厂家生产的胰蛋白酶具有相同的活性，并且可以使医生和患者更容易比较不同品牌或批次的胰蛋白酶的治疗效果。
总结起来，胰蛋白酶作为一种重要的消化酶，其药典标准规定了胰蛋白酶的质量要求、生产工艺和检测方法等方面。
通过遵循这些标准，可以确保胰蛋白酶在临床应用中的质量和疗效，促进患者的康复。
医生和患者可以放心使用符合药典标准的胰蛋白酶，获得更好的治疗效果。
胰蛋白酶抑制因子的活性测定方法
Tro缓 冲溶液 ,在 涡旋搅
拌器 上 搅拌 3min,然 后加入 10.00ml Tro缓 冲溶液 t室 涅 下静止 10min,待 大部 分固体絮状 物质凝集下来后用滤纸过滤 (豆 粕样 品提取液再用 Tr。 缓冲溶液稀释 0o或 zO倍 )c
4反 应
4,1样 品空 白和试剂 空 白:分 别将 2.00ml样 品稀释液和 2.∞ ml蒸 镭水加 入 1omI试 管 中 。
备注 :由 于分析操作存在难 以避免 的随机误差 ,造 成 同一 样 品在不 同时间 (人 )检 测 时产 生 偏差 ,为 避免分析过程 中的随机实验误 差 ,我 们提示您用 同一 豆粕 样 品做参 比对照 。
■
胰蛋 白酶抑制因子活性测定方法
1原 理
胰蛋 白酶抑制剂 能够 和骧蛋 白酶结合 ,通 过 测定底物
(BAPA)被 未结合 的胰 蛋 白酶酶
解生成 的 产物一对硝基苯孩溶液 妁吸光 度 ,然 后 以它和未加抑制剂 的标准吸光度之差来表示 被抑制 的胰蛋 白酶活性
c
2材 料
2.1Tro缓 冲溶液 :溶 解 6.050g羟 甲基 氨墓 甲烷 itHs)和
试管 内 ,加 入
5。
2,∞ mI稀 释液于 10ml
00ml BAPA溶 液后在 37℃ 下保温 ⒛ min,加 入 2.∞ ml猪 咦蛋 白酶溶液 ,然 后
在水浴 中保温 10min,再 加
1m13o%醋 酸溶液 中止反应 。
5测 量
在
3gsnm(或 410nm)下 用试剂空 自校零和测定标准 、样 品和样 品空 白的吸光值 ,计
在 夕 ℃下保温 ⒛ min,各 加入 5,00ml BAPA溶 液 ,混 合 后在 37℃ 下 倮温 10min,分 别加入
胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
实验六 用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶
实验六用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶Ⅰ反胶束萃取法提取胰蛋白酶一、实验目的和要求1、加深对反胶束萃取基本原理的理解。
2、了解反胶束萃取的工艺过程及影响因素。
3、了解胰蛋白酶酶话的测定方法和原理。
4、研究pH对萃取率和反胶束率的影响规律，求出适宜的萃取pH值。
二、实验原理反胶束萃取技术是近年来发展的具有开发前景的新型分离技术。
他是由表面活性剂分散在有机溶剂（连续相）中，自发形成纳米级的聚集体，称反胶束（或称反胶团）。
在反胶束溶液中，组成反胶束的表面活性剂定向排列，其非极性尾向外伸入非极性有机溶剂的有机主体中，而极性头向内排列，形成一个极性核，核内充满水溶液，具有溶解蛋白质之类大分子物质的能力。
当含有反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电引力、疏水作用或亲和力等推动作用力下溶入极性核，从而被萃取，然后再控制适当的条件使蛋白质从负载有机相中重新反萃取到水相，达到纯化的目的。
影响反胶束萃取的因素很多，主要有水相溶液的pH、离子强度、表面活性剂和有机溶剂的种类、浓度和温度等。
胰蛋白酶（trypsin）广泛存在于动物的胰中，是由胰腺腺泡细胞合成的肽链内切酶，分Ⅰ型和Ⅱ型两种，其相应前体分别胰蛋白酶原Ⅰ（CTN）和胰蛋白酶原Ⅱ（ATN）。
正常胰液中胰蛋白酶原占总蛋白质含量的19%，CTN 是AT N 的2倍.胰蛋白酶为白色或类白色结晶性粉末，等电点pI = 10.8。
胰蛋白酶是生物化学尤其是蛋白质组学研究的重要试剂。
它具有分解肽链的作用，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此能使浓痰液、血凝块等消化变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，而不损伤正常组织或损伤极微（因血清内有胰蛋白酶抑制物）。
可帮助创伤或手术后伤口愈合，治疗烧伤，具有多种药用价值。
此外，还有抗炎作用。
临床上可用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、瘘管等所产生的局部水肿、血肿、脓肿等。
喷雾吸入，用于治疗呼吸道疾病。
胰蛋白酶存放于密闭，阴凉处保存。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。
实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。
胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。
这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。
不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。
E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。
由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。
在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。
器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。
试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。
1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。
2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的活力的测定
操作方法
取2个光程为1厘米的石英比色杯，分别加入25℃预热 过 的 2.8ml 底 物 溶 液 。 向 一 只 比 色 杯 中 加 入 0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收 零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀 并记时，每半分钟读数一次，共读3~4分钟。
域，与催化作用直接相关。
活性中心
结合部位 （底物）
催化部位（底物的键在此处被打断或形成新 的键）
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸酶等。
国际系统命名法 分类 催化的反应性质不同 分称酶原。由无活性酶 原转变为有活性酶的过程称酶原激活。
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法 进行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英 文缩写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱 于苯甲酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白 酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸 逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：
以 BAEE 为 底 物 反 应 液 pH8.0 ， 25℃ ， 反 应 体 积 3.0ml ， 光 径 1 厘 米 的 条 件 下 ， 测 定 A253 ， 每 分 钟 使 A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单 位。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
实验十一 注射用胰蛋白酶效价测定
实验十一注射用胰蛋白酶效价测定一、实验目的1掌握胰蛋白酶活力的测定方法-酶速率测定法。
2掌握紫外分光光度计的原理和使用方法。
二、实验原理N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进行测定的原理是：N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L-精氨酸。
在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L-精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收随之相应增加。
2010版药典指出胰蛋白酶注射剂中含胰蛋白酶的活力单位应为标示量的90.0%-120.0%；若按干燥品计箅，则每1mg中胰蛋白酶的活力不得少于2500单位。
酶活单位定义：在底物BAEE浓度1mmol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25℃，测量体积3ml,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。
三、试剂与器材1.材料胰蛋白酶注射剂：规格（1)1. 2 5万单位（2)2. 5万单位（3)5万单位(4)10万单位N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐2.试剂(1)0.001mol/L盐酸溶液：取12mol/L的浓盐酸83.33ml与916.67ml蒸馏水混合。
(2)0. 067mol/L磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾9.112g溶于1000ml蒸馏水中。
(3)0. 067mol/L磷酸氢二钠溶液：取磷酸二氢钠8.04g溶于1000ml蒸馏水中。
(4)磷酸盐缓冲液：0. 067 m o l / L磷酸二氢钾溶液13mL与0. 067mol/L磷酸氢二钠溶液87ml混合，pH值为7. 6。
3.器材试管及试管架、移液管、100ml容量瓶、紫外分光光度计等。
四、实验步骤1.底物溶液的制备取N - 苯甲酰- L - 精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg，加水溶解使成100m l，作为底物原液；取10ml，用磷酸盐缓冲液稀释成100ml ，用紫外- 可见分光光度法（附录IV A ) ，恒温于25. 0°C ± 0 . 5°C ，以水作空白，在253nm的波长处测定吸光度，必要时可用上述底物原液或磷酸盐缓冲液调节，使吸光度在0. 575-0. 585之间，作为底物溶液。
胰蛋白酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）
胰蛋⽩酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）正式测定前务必取2-3个预期差异较⼤的样本做预测定测定意义：胰蛋⽩酶选择性⽔解变性蛋⽩质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是⼀种重要的消化酶。
此外，胰蛋⽩酶还⼴泛应⽤于脓胸、⾎胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产⽣的局部⽔肿、⾎肿及脓肿等的辅助治疗。
测定原理：胰蛋⽩酶催化⽔解TAME的酯键，释放出的游离羧基与反应体系中的氢氧化钠发⽣中和反应，导致溶液的pH值降低，以**红为指⽰剂，测定溶液在555nm处吸收值的变化，可以快速测得胰蛋⽩酶活性数据。
胰蛋⽩酶在⼀定范围内与555nm处吸收值的降低呈良好的线性关系。
组成：产品名称PI007-50T/48S Storage提取液：液体60ml4试剂⼀：液体10ml4试剂⼆：液体10ml4避光试剂三：液体4ml4说明书⼀份⾃备仪器和⽤品：紫外可见分光光度计、1ml玻璃⽐⾊⽫、台式离⼼机、⽔浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏⽔。
粗酶液提取：提取：粗酶液1、组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的⽐例（建议称取约0.1g组织，加⼊1ml提取液）冰浴匀浆，10000g，4离⼼10min，取上清，即粗酶液。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长⾄555nm，蒸馏⽔调零。
⼯作液的配制：临⽤前根据⽤量按照试剂⼀（V）：试剂⼆（V）：蒸馏⽔（V）：试剂三（V）=1ml：1ml：5.4ml：0.4ml的⽐例充（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶）分混合。
（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有3. 吸取25µl样本，加⼊975µl⼯作液，混匀后⽴即测定，记录555nm下1min时的吸光值A1和2min时的吸光值A2。
计算A=A1-A2注意：如果A⼩于0.005，可将反应时间延长到5min。
如果A⼤于0.5，体系迅速变⾊，可将样本⽤提取液稀释后测定（建议稀释10倍），计算公式中乘以相应稀释倍数。
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中国海洋大学实验报告
姓名庞裕智专业年级生命基地班2011 题目胰蛋白酶活力的测定
学号040312011025 科目生物化学实验时间周一90节同组者田特
一、实验目的
学习和掌握胰蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理
福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
三、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
四、实验试剂、
1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)
2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml
3、10%三氯乙酸溶液
4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：
5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液
7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)
五、实验步骤
标准曲线的制作：按下表加入试剂：
滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂
六、实验结果
酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
由标准曲线知，当OD680=0.244时，样品中酪氨酸的微克数为A=181ug ∴样品中胰蛋白酶活力单位为181/15×13=156.87
七、实验分析
1.注意事项
（1）胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；
（2）要在酶的最适温度40℃下反应；
（3）要在酶的最适PH为7.5调节下反应；
（4）催化反应的时间控制精确；
（5）向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；
（6）加入各种药品的量要精确，特别是酶。
2.思考题
（1）酶的实验为何设对照又设空白？
在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
（2）如何保证本实验测定数据的准确性？
①胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；
②要在酶的最适温度40℃下反应；
③要在酶的最适PH为7.5调节下反应；
④催化反应的时间控制精确；
⑤向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；
⑥加入各种药品的量要精确，特别是酶。
（3）稀释的酶液是否可以长期保存？为什么？
稀释的酶溶液不能长期使用。
因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。