科研思路和方法作业

从MHCⅠ/Ⅱ类相关因子探讨针灸对带状疱疹的免疫逃避作用学号：12007076 姓名：李建伟专业：中医外科学(一)研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题1.研究内容课题以VZV免疫逃避机制中发挥着重要作用的感染病毒细胞免疫识别的MHCⅠ/Ⅱ类基因抑制为切入点，围绕IFN-γ和参与免疫逃避的的两条主要途径，有目的地观察IFN-γ和相关基因CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律，进一步检测CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA的表达变化以及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性的动态变化，并对上述指标的相关性及变化规律进行分析，说明调节VZV病毒感染的免疫逃避机制是针灸治疗带状疱疹、减轻疼痛和后遗症的关键。

且明确针刺与放血作用机制的差异所在。

主要开展以下工作：研究内容：（1）皮损组织病理学观察。

（2）镜检：外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。

（3）流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。

（4）免疫组化法ABC染色法检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。

（5）western blot检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHC Ⅰ、MHCⅡ蛋白量的表达。

（6）RT-PCR法检测：皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。

2.研究目标：2.2.1旨在明确针灸治疗带状疱疹，减轻疼痛和后遗神经痛，与调节MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的分布及表达关系，为针灸治疗免疫逃避类疾病提供科学依据。

2.2.2通过比较针灸与传统抗病毒药物的作用差异，为解决带状疱疹病毒耐药性问题提供理论依据。

2.2.3旨在明确针刺与放血在治疗疱疹作用机制中的差异。

3.拟解决的关键性问题：针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的调节与其有效干预VZV病毒免疫逃避机制的关系。

(二)拟采用的方案及可行性分析1.拟采用的方案实验环境：实验室相对封闭，自然采光，环境温度控制在20℃～25℃之间，湿度控制在60%左右。

实验动物：清洁级昆明种小鼠，体重22～24g，笼养，自由饮食，由上海市实验动物中心提供全价动物颗粒饲料。

1.1分组及造模：第一次实验采用大鼠192只，按照体重分层随机，分为6组，每组8只，在造模完成后开始治疗，连续7天，隔日（第1、3、5、7天）处死一批，动态观察针刺放血对大鼠VZV病毒初感染的影响；第二次实验在造模后30天开始治疗，观察针刺放血对大鼠VZV病毒潜伏、复发的影响，其他处理同上，第7天处死取材观察；造模：腹腔注射VZV8805株系病毒，按照100TCID50/0.1ml病毒量接种细胞，感染后48小时，模型即成。

模型组：造模方法同上，每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定，连续7天。

药物组：造模方法同上。

左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d，连续三天，每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定，连续7天。

针刺组：造模方法同上。

按照造模时间的先后顺序，在造模完成后，开始针刺，进针0.2～0.3mm，平补平泻，留针10min，每日1次，连续7天。

放血组：造模方法同上。

按照造模时间的先后顺序，使用皮肤针沿皮损和脊神经叩刺，连续7天。

针刺加放血组：方法同针刺组和放血组，治疗连续7天。

正常组：腹腔注射同体积生理盐水。

每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定，连续7天。

1.2 取材方法：造模结束后，在模型组40只中随机处死8只，取材检测VZV对对小鼠相关指标的影响。

针刺组、放血组、针刺加放血组、药物组、正常组在治疗后的第1、3、5、7天随机处死8只小鼠取材。

取材放入-80o C低温冰箱保存、备检。

1.3穴位选取：固定小鼠方法：根据小鼠的形体，在木板上钉上四个适当距离的铁钉，将夹子套在铁钉上，用夹子夹住小鼠的四肢以做固定。

小鼠穴位定位参考《实验针灸学》，模拟小鼠的定位方法：“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间；“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间，左右侧各一穴；“合谷”在在手背，当第二掌骨桡侧的中点处，“曲池”在在肘横纹外侧端，当尺泽与肱骨外上髁连线中点，“委中”在在腘横纹中点，当股二头肌腱与半腱肌腱的中间，“尺泽”在在肘横纹中，肱二头肌腱桡侧凹陷处。

1.4 观察指标及方法：1.4.1皮肤组织病理切片1.4.2镜检：外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数各组小鼠每天定时，专人割尾静脉采血10μl，加入0.38ml的白细胞稀释液中，摇匀，静置3分钟，光镜查外周血有核细胞、白细胞数和淋巴细胞、巨噬细胞分类计数；1.4.3流式细胞仪检测：外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。

①制备样品：处死动物，离心，收集细胞悬液，滴加特异性免疫荧光抗体，用流式细胞仪上机检测并进行分选。

②流式细胞仪检测：将分选细胞清洗、离心(1500RPM，10min)，清洗两次，弃上清；加入PI荧光标记抗体；用流氏细胞仪分别检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。

③分析方法：测出的数据经PHOENIX公司分析软件Multicycle处理，得出细胞各周期的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞相对含量和百分数,并绘出DNA分布的直方图。

1.4.4免疫组化法ABC染色法检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。

①制备样品：处死动物，取股骨骨髓，10%福尔马林固定标本，石蜡包埋，4μm厚切片。

②免疫组化染色检测方法：鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(DO-27)（武汉博士德（NeoMarker 生物有限责任公司，浓度1:50）；鼠抗人cyclinD1单克隆抗体（DCS/6）福州迈新公司，浓度1:100）；鼠抗人单克隆抗体CⅡTa 、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ（晶美公司）；S-P免疫组化试剂盒（北京中山公司）。

ABC法：用0.1 mol/L PBST洗，切片与0.1mol/L PBST(含0.5%H2O2)作用30 min，用0.1mol/L PBST 洗,10 min×3次，与一抗4℃温育，用0.1 mol/L PBST洗,10 min×3次，与二抗(1:1000稀释)室温作用2 h，用0.1 mol/L PBST洗，10 min×3次，与ABC(1:2000稀释)室温作用1 h.用0.1mol/L PBST洗，10 min×3次.在DAB溶液中反应，用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液终止反应，用包被有明胶的玻片固定、水洗，用系列浓度乙醇(70%1次，80%1次，90%2次，95%2次，100%3次，每次5 min)脱水，二甲苯中透明，封边。

③分析方法：IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ免疫组化阳性信号均为棕黄色细颗粒状，染色结果按阳性细胞百分比及染色强度综合记分作半定量分析。

1.4.5 western blot检测：皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHC Ⅰ、MHCⅡ蛋白量的表达。

①制备样品：取样品1×106～1×107细胞，PBS清洗，去PBS加0.1～1ml 总蛋白抽提试剂抽提总蛋白；使用KCTMBCA蛋白质定量试剂盒，测定样品浓度。

②方法：变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)；蛋白质转移到硝酸纤维膜，30mA恒流，4°C转移，过夜；膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时，加入一级抗体室温孵育1.5小时；加入HRP标记的二级抗体，室温孵育1小时；化学发光法检测，X胶片曝光显影。

③分析方法：扫描图片，用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化；将目的蛋白灰度值除以内参GAPDF的灰度值，校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

1.4.6 RT-PCR法检测：皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。

①提取总RNA：取标本，用试剂(GIB-CO公司，美国)提取总RNA，溶于无RNA酶的灭菌超纯水中，用紫外分光分度计测定总RNA的浓度和纯度，同时琼脂糖电泳观察其完整性。

将RNA稀释成1mg/L，-80°C保存。

② MHCⅠ、MHCⅡ和β-actin引物序列CⅡTa: 5′-ACTCGATATCATTCCGGCAGACCTGAAGCAT-3′5′-GCTCACTGCC-CCAGCCCAATA-3′MHCⅠ: 5’- TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3’5’-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA- 3’MHCⅡ: 5’-ACCAACGGGACGAGCGCAT-3’5’-CAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3’β-actin: 5’- AACGGCTCCGGCATGTGCAA - 3’5’-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3’PCR反应体系30μl，转录产物3μl，2U Taq DNA聚合酶，10mmol/L 4×dNTP 2μlPOLβ和β-actin引物。

反应条件：94°C预变性；94°C 50s，55°C 55s，72°C 60s，72°C 10min共30个循环。

③分析方法：产物经SYNGENE凝胶成像系统分析，以目的基因和β-actin 积分灰度值的比值，作为目的基因mRNA的相对表达量。

研究路线3.可行性分析：1、本人针灸专业硕士、中医外科皮肤病方向在读博士，多学科背景保证实验研究按计划进展并不断推向深入。

2、前期大量的临床实践和文献回顾性研究显示出针刺放血可改善VZV感染机体免疫功能；3、研究思路清晰，目的明确，有成熟的理论指导，所选指标针对性强，研究方案可行，研究方法及技术路线成熟；4、实验室的软件、硬件设备完全具备科研条件。

上海中医药大学实验室条件先进，课题所需仪器设备均已具有，所需试剂、抗体均可购买。

5、课题组成员层次结构、知识结构合理，有较强的科研能力和团结协作精神。

4.本项目的特色与创新之处1、首次开展针灸对VZV免疫逃避机制的研究，进一步揭示针灸改善调节VZV感染机体免疫功能的的分子生物学机制，也为针灸治疗病毒感染的相关疾病提供了理论依据。

2、通过研究针灸对带状疱疹后遗神经痛的调节机制，促进临床药物、针刺放血等多种疗法相结合，提高临床疗效，更具实际意义。

3、首次探讨针刺与放血疗法在改善VZV感染机体免疫功能中的差异，为两种疗法治疗不同病理的相关疾病提供实验依据。