《分子杂交技术》PPT课件
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cDNA探针
用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适 用于基因表达的检测。
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8
RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待 测核酸顺序杂交的效率较高。
探针的分类
探针的标记
标记物
6
一、探针的分类
根据核酸探针的来源及性质可分为：
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
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7
•DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点
有下面三点：
①这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。
②DNA探针不易降解（相对RNA而言）
③DNA探针的标记方法较成熟
③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这 种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够 用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。
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二、探针的标记
切口平移法(nick translation) 随机引物法 聚合酶链式反应法
T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 DNA快速末端标记 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在
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三、标记物
放射性同位素
1）灵敏度极高，可以检测10-14~10-18 g 的物质。最适条 件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。
2） 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对 酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳 定性和杂交性质。
3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 其缺点是： 1）放射性污染。 2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。 3）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d
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T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端
寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记， 寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4噬 菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将γ-32P-ATP 上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核 苷酸5’端必须带羟基。反应式为：
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聚合酶链反应
➢PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比 活性DNA探针。 ➢PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内大量合成探 针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的 dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的 掺入率可高达70%～80%。 ➢因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标 记。 ➢该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。 ➢使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标 记效果。
第九章 分子杂交技术
Hybridization technique
概念： 在DNA与DNA， DNA与RNA之间，存在 着 碱基互补的关系，在加热或 加入变性剂等条件下，DNA 双链之间的氢键被破坏，双 链解开成为单链，此时加入 有互补序列的DNA或RNA， 在一定离子强度和温度下保 温，则加入的DNA或RNA可 与模板链形成稳定的DNADNA或DNA-RNA异源双链， 此过程称为杂交。
③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。
④杂交后可用Rnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本 底降低。
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寡核苷酸探针
①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量 靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。
②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短 探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。
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主要内容
核酸杂交的基本理论
核酸探针
核酸分子杂交方法
蛋白质分子杂交
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2
第一节 核酸杂交的基本理论— DNA的变性与复性
DNA变性
方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解 温度(melting temperature,Tm)
3H/12.1y ）。
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常用的放射性同位素有：
1）32P放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短， 灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。
射线散射严重，分辨率不高 2）35S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高 （可用于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。
核酸上
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切口平移法
➢该技术由Kelly等于1970年创立。 ➢其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制 造一些切口（nick ）,切口处会形成3’—羟基末端，这时再在 大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基 上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶 活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。 ➢其结果是在切口平移。 ➢用切口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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3
核酸分子杂交的原理
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4
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第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
主 要 内 容
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随机引物延伸（random primer)
➢这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选 用的方法。 ➢原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板 退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火 到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应 时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后， 新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小 的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可 与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物 （random primer）。 ➢这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。
用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适 用于基因表达的检测。
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RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待 测核酸顺序杂交的效率较高。
探针的分类
探针的标记
标记物
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一、探针的分类
根据核酸探针的来源及性质可分为：
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
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•DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点
有下面三点：
①这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。
②DNA探针不易降解（相对RNA而言）
③DNA探针的标记方法较成熟
③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这 种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够 用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。
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二、探针的标记
切口平移法(nick translation) 随机引物法 聚合酶链式反应法
T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 DNA快速末端标记 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在
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三、标记物
放射性同位素
1）灵敏度极高，可以检测10-14~10-18 g 的物质。最适条 件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。
2） 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对 酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳 定性和杂交性质。
3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 其缺点是： 1）放射性污染。 2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。 3）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d
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T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端
寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记， 寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4噬 菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将γ-32P-ATP 上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核 苷酸5’端必须带羟基。反应式为：
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聚合酶链反应
➢PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比 活性DNA探针。 ➢PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内大量合成探 针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的 dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的 掺入率可高达70%～80%。 ➢因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标 记。 ➢该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。 ➢使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标 记效果。
第九章 分子杂交技术
Hybridization technique
概念： 在DNA与DNA， DNA与RNA之间，存在 着 碱基互补的关系，在加热或 加入变性剂等条件下，DNA 双链之间的氢键被破坏，双 链解开成为单链，此时加入 有互补序列的DNA或RNA， 在一定离子强度和温度下保 温，则加入的DNA或RNA可 与模板链形成稳定的DNADNA或DNA-RNA异源双链， 此过程称为杂交。
③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。
④杂交后可用Rnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本 底降低。
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寡核苷酸探针
①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量 靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。
②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短 探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。
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主要内容
核酸杂交的基本理论
核酸探针
核酸分子杂交方法
蛋白质分子杂交
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第一节 核酸杂交的基本理论— DNA的变性与复性
DNA变性
方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解 温度(melting temperature,Tm)
3H/12.1y ）。
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常用的放射性同位素有：
1）32P放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短， 灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。
射线散射严重，分辨率不高 2）35S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高 （可用于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。
核酸上
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11
切口平移法
➢该技术由Kelly等于1970年创立。 ➢其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制 造一些切口（nick ）,切口处会形成3’—羟基末端，这时再在 大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基 上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶 活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。 ➢其结果是在切口平移。 ➢用切口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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核酸分子杂交的原理
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第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
主 要 内 容
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随机引物延伸（random primer)
➢这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选 用的方法。 ➢原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板 退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火 到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应 时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后， 新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小 的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可 与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物 （random primer）。 ➢这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。