《分子杂交技术》PPT课件
合集下载
基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)
通过放射自显影或生化检测， 就可判断滤膜上是否存在与探针 同源的DNA分子及其分子量。
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
15
一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
26
(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
ppt课件
27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
基因组学课件 第8章 分子杂交与印迹技术
➢ 操作步骤：
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
50
3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
51
3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
64
2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
59
4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
60
4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
50
3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
51
3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
64
2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
59
4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
60
4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）
核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件
第43页/共46页
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
第44页/共46页
（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
第41页/共46页
（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
第42页/共46页
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
第19页/共46页
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
第44页/共46页
（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
第40页/共46页
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
第41页/共46页
（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
第42页/共46页
（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
第19页/共46页
四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
[课件]核酸分子杂交与应用PPT
![[课件]核酸分子杂交与应用PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/1956ac56f46527d3240ce0db.png)
2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
分子杂交技术
Slide 28 of 40
5．聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针 DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达 70%～80%。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非 放射性标记。
(三）非放射性探针的显示体系
标记物性质 生物素 标记分子
Bio-11-dUTP
标记方法
杂交体的检测法
NT 、 TL 、 酶标亲合素或酶标抗生物 PCR 素抗体显色
半抗原
地高辛
RPL , PCR
酶标抗体 + 底物显色
* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶链反应；RPL： 随机引物标记； TL：末端标记
（二）核酸探针的非放射性标记技术 1．光敏生物素标记核酸 目前使用的光标生物素试剂有两种： 光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都有一个光敏 基团。 2．酶促生物素标记核酸 以生物素化的脱氧核苷三磷酸 （Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应32P 标记的脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入DNA。 3．寡核苷酸的生物素末端标记 有5’-磷酸的化学标记法和 3’-OH的酶促标记法。前者将寡核苷酸的5’-磷酸接上一个乙二胺， 然后用琥珀酰亚胺生物素，将生物素基团连接在磷酸酰胺基上。 后者是用末端转移将Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脱去一个焦 磷酸）。 4．酶标DNA 标记试剂是辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶 （AP）。通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成 （HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结 合，使HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。
基因探针分子杂交技术
❖ 如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过 与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两 者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度, 检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这 便是核酸探针分析的基本原理。
分子杂交技术的分类
❖ 根据探针来源的不同，可分为
可以与dCTP连接成地高辛-dCTP
电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。
目前已知的三千多种遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测基因的表达产物(蛋白质或酶)的改变予以诊断。
Southern杂交
DNA
核酸
Northern杂交
RNA
核酸
Western杂交 蛋白质
抗体
基本操作程序
印迹（blotting）
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
Southern杂交
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交 检测与分析
检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
分子杂交技术的分类
❖ 根据探针来源的不同，可分为
可以与dCTP连接成地高辛-dCTP
电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。
目前已知的三千多种遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测基因的表达产物(蛋白质或酶)的改变予以诊断。
Southern杂交
DNA
核酸
Northern杂交
RNA
核酸
Western杂交 蛋白质
抗体
基本操作程序
印迹（blotting）
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
Southern杂交
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交 检测与分析
检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
精选课件ppt
7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
精选课件ppt
22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
精选课件ppt
12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
精选课件ppt
13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
精选课件ppt
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
精选课件ppt
7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
精选课件ppt
22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
精选课件ppt
12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
精选课件ppt
13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
精选课件ppt
第十五章-分子杂交技术讲稿
第十五章分子杂交技术第一节核酸杂交的基本原理1、核酸分子杂交定义：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把 DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链（heteroduplex）（参照图讲解）。
2、探针技术2.1 探针 (probe) 定义：一段常用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在（参照图讲解）。
2.2 探针形式（举例说明）3、核酸的变性⏹在物理或化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋成为单链的过程称为核酸的变性（denaturation）。
⏹变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
加热变性是实验室最常用的方法⏹一般当温度在70℃以内时，DNA几乎不变性；⏹温度在70～90℃之间时，DNA部分变性；⏹温度大于90 ℃时，DNA变性使双链打开，温度大于100℃时，DNA双链分离。
增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。
⏹在热变性过程中，通常将增色效应达一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为变性温度或融解温度（melting temperature），用Tm表示。
⏹影响 Tm值的因素：（1）碱基的组成：GC含量愈高的DNA不易变化，其Tm值愈高。
在标准条件下即0.15mol/L Nacl 0.15mol/L柠檬酸钠溶液中（1×ssc）， Tm值与碱基对组成之间的经验公式是：Tm =69.3+0.14（G+C）%Tm值还与DNA分子的长度有关，DNA分子越长，Tm值越大。
（2）溶液的离子强度：在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。
同一种DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同。
在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。
（3）pH值：核酸溶液的pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。
《病理学》分子杂交技术
• RNA酶保护分析法 • 核酸酶S1保护分析法
第三节 探针的标记
一、探针的种类 二、标记物 三、探针标记方法 四、探针的纯化
一、探针的种类
– cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针
二、标记物
– 核素标记物（同位素标记）：32P、 35S、3H等
– 非核素标记物（非同位素标记）： 生物素、地高辛、荧光素等
CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化 （缺失、复制、扩增），并能将这些异常在 染色体上定位。该方法通过同一次实验即可 扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。
五、 Western 印迹法(Western bloting)
• 检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转 移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋 白质进行鉴定及定量的方法
探针
Northern hybridization
Southern hybridization
Juang RH (2004) BCbasics
一、DNA变性与复性
1.DNA变性
①定义：氢键断裂，单链 ②方法:热变性: 90~100℃ 熔解温度(Tm)
酸碱变性:常采用碱变性 化学试剂变性;尿素、甲醛等
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列* 从cDNA获取目的基因mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
分子杂交技术
• 杂交的基本原理 • 杂交的基本方法 • 探针的标记
第一节 核酸分子杂交的基本原理
• 核酸分子杂交的基本原理：具有 互补序列的两条核酸单链在一定 条件下，按碱基配对原则形成双 链的过程。
第三节 探针的标记
一、探针的种类 二、标记物 三、探针标记方法 四、探针的纯化
一、探针的种类
– cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针
二、标记物
– 核素标记物（同位素标记）：32P、 35S、3H等
– 非核素标记物（非同位素标记）： 生物素、地高辛、荧光素等
CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化 （缺失、复制、扩增），并能将这些异常在 染色体上定位。该方法通过同一次实验即可 扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。
五、 Western 印迹法(Western bloting)
• 检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转 移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋 白质进行鉴定及定量的方法
探针
Northern hybridization
Southern hybridization
Juang RH (2004) BCbasics
一、DNA变性与复性
1.DNA变性
①定义：氢键断裂，单链 ②方法:热变性: 90~100℃ 熔解温度(Tm)
酸碱变性:常采用碱变性 化学试剂变性;尿素、甲醛等
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列* 从cDNA获取目的基因mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
分子杂交技术
• 杂交的基本原理 • 杂交的基本方法 • 探针的标记
第一节 核酸分子杂交的基本原理
• 核酸分子杂交的基本原理：具有 互补序列的两条核酸单链在一定 条件下，按碱基配对原则形成双 链的过程。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
精选课件ppt
12
精选课件ppt
13
随机引物延伸（random primer)
➢这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选 用的方法。 ➢原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板 退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火 到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应 时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后， 新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小 的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可 与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物 （random primer）。 ➢这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。
第九章 分子杂交技术
Hybridization technique
概念： 在DNA与DNA， DNA与RNA之间，存在 着 碱基互补的关系，在加热或 加入变性剂等条件下，DNA 双链之间的氢键被破坏，双 链解开成为单链，此时加入 有互补序列的DNA或RNA， 在一定离子强度和温度下保 温，则加入的DNA或RNA可 与模板链形成稳定的DNADNA或DNA-RNA异源双链， 此过程称为杂交。
cDNA探针
用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适 用于基因表达的检测。
精选课件ppt
8
RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待 测核酸顺序杂交的效率较高。
探针的分类
探针的标记
标记物
6
一、探针的分类
根据核酸探针的来源及性质可分为：
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
精选课件ppt
7
•DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点
有下面三点：
①这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。
②DNA探针不易降解（相对RNA而言）
③DNA探针的标记同位素
1）灵敏度极高，可以检测10-14~10-18 g 的物质。最适条 件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。
2） 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对 酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳 定性和杂交性质。
3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 其缺点是： 1）放射性污染。 2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。 3）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d
3H/12.1y ）。
精选课件ppt
19
常用的放射性同位素有：
1）32P放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短， 灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。
射线散射严重，分辨率不高 2）35S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高 （可用于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。
③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。
④杂交后可用Rnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本 底降低。
精选课件ppt
9
寡核苷酸探针
①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量 靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。
②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短 探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。
核酸上
精选课件ppt
11
切口平移法
➢该技术由Kelly等于1970年创立。 ➢其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制 造一些切口（nick ）,切口处会形成3’—羟基末端，这时再在 大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基 上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶 活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。 ➢其结果是在切口平移。 ➢用切口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。
③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这 种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够 用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。
精选课件ppt
10
二、探针的标记
切口平移法(nick translation) 随机引物法 聚合酶链式反应法
T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 DNA快速末端标记 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在
精选课件ppt
14
精选课件ppt
15
聚合酶链反应
➢PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比 活性DNA探针。 ➢PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内大量合成探 针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的 dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的 掺入率可高达70%～80%。 ➢因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标 记。 ➢该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。 ➢使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标 记效果。
精选课件ppt
1
主要内容
核酸杂交的基本理论
核酸探针
核酸分子杂交方法
蛋白质分子杂交
精选课件ppt
2
第一节 核酸杂交的基本理论— DNA的变性与复性
DNA变性
方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解 温度(melting temperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
3
核酸分子杂交的原理
精选课件ppt
4
精选课件ppt
5
第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
主 要 内 容
精选课件ppt
精选课件ppt
16
精选课件ppt
17
T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端
寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记， 寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4噬 菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将γ-32P-ATP 上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核 苷酸5’端必须带羟基。反应式为：