第六章 抗体的表达

学活性时间即抗体的半衰期，那么就需要选择全抗体，
需要利用培养的动物细胞或转基因动物来表达。
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原核表达系统操作简单、成本低、周期短，应用最为 广泛，但不能对表达产物进行糖基化，且细菌类毒素 污染很难去除。重组的蛋白常以包涵体形式分泌，要 在体外折叠，费时费力，这使得大规模生产抗体受到 限制。 真核表达系统是最接近天然产生抗体的表达系统，比 较成熟且应用较多。主要用于表达完整抗体分子，已 可达到100mg/L的表达水平。但真核细胞培养有难 度，需要附加设备，需要去除癌基因序列，防止病毒 污染等。
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第四节 动植物表达系统
动植物表达系统（动植物反应器）比传统的微生物和动物 细胞表达系统产量高，成本低，而且蛋白产物可进行正确修饰， 生物活性完整，适于表达结构复杂的大分子药用蛋白，如糖蛋 白、磷蛋白、多亚基蛋白等。 转基因动物：多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。 制作转基因动物的步骤：获得和改建目的基因，将目的基 因向生殖细胞高效转移，受精卵或胚胎组织在合适环境中 的发育、筛选及鉴定稳定的细胞系。
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pGEX系列表达载体
• 1987年，澳大利亚的smith和Johnson构建了表达融合 蛋白的载体pGEX。pGEX系列表达载体就是采用GST作 为载体的标签。它作为标签的好处在于它是一个高度可溶 的蛋白，希望通过它提高蛋白的可溶性；另一个原因是它 可以在大肠杆菌中大量表达。
载体名称 识别切割GST标签的酶
始密码子和S-D序列。
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原核表达系统主要有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表
达系统、链霉素表达系统以及枯草杆菌和蓝细菌表达 系统等。 大肠杆菌遗传背景清楚，遗传图谱明确，生物化学与 分子生物学充分了解，目的意淫表达产量高，生产成
本低，周期短等，因此仍是表达异源性蛋白质的首选
表达系统。 受大肠杆菌自身加工能力的限制，不适合表达完整的 抗体分子，多用来选择性表达Fab或scFV等抗体片段。
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一般操作步骤： 目的基因克隆 重组载体线性化 转化 筛选 外源蛋白的表达 鉴定 放大
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哺乳动物细胞表达系统优缺点：表达的外源蛋白最接近其天
然构象，在蛋白合成起始信号、加工、分泌、糖基化方面具 有独特优势，但在大规模培养时细胞会面临着对无血清培养 基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等难题。 外源基因导入的方法：脂质体、磷酸钙、电穿孔及显微注射
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利用植物表达外源蛋白的优点： 植物繁殖能力强，可以利用愈伤组织或原生质体连续培养； 可以把外源DNA整合到基因组中获得转基因植株； 一旦获得某重组抗体的转化株，要提高其产量只是农艺性 状改良问题； 能有效地组装轻链和全长重链，形成完整的抗体分子。
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原核细胞表达系统基因表达的主要特点是：
1、原核生物只有一种RNA酶，识别原核细胞启动子，催
化所有RNA的合成，且其基因表达是以操纵子为单位。 2、转录和翻译是耦联的，连续进行。 3、缺乏真核细胞转录后的加工系统，不能去除内含子。 4、原核细胞的基因控制主要在转录水平。
5、在大肠杆菌mRNA核糖体结合位点上，有一个转录起
第六章 抗体的表达
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第一节 概述
目前抗体的主要类型： 1、多克隆抗体：通过免疫手段制备。
2、单克隆抗体：通过杂交瘤技术制备。
3、基因工程抗体：包括嵌合抗体、改型抗体等，通过 基因工程手段制备，涉及设计、构建与表达等。
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要想获得全长的抗体分子，就必须选择恰当的抗体表 达系统，而要使所表达的蛋白质结构不具有免疫原性 或避免半衰期过短，就需要使用一个标准的抗体工程 技术生产全人抗体。 在抗体表达过程中，选择一种合适的表达系统，要考 虑多种因素的影响，包括抗体的结构、糖基化作用以 及表达抗体的产量、纯化的难易度和生产成本等。 目前用于抗体表达的系统有原核表达系统和真核表达 系统两大类。
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第三节 真核表达系统
真核表达系统主要包括哺乳动物表达系统、昆虫表达 系统以及酵母表达系统。 真核生物基因组的特点： 1、比原核基因组大得多； 2、真核生物主要遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分，增加了基因表达调控的层 次和复杂性； 3、真核基因组为二倍体，原核基本为单倍体； 4、真核生物mRNA为单顺反子，而许多活性蛋白是由相同 或不同的多肽形成的亚基构成。 5、哺乳动物基因组中仅约10%的序列为蛋白质； 6、真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即 有外显子和内含子，转录后需经剪接去除内含子； 7、哺乳动物基因组中存在大量重复序列。
链长 pCold ⅠDNA pCold ⅡDNA pCold Ⅲ DNA pCold Ⅳ DNA 4407bp 4392bp 4377bp 4359bp TEE序列 有 有 有 无 His Tag标签 有 有 无 无 Factor Xa切断序列 有 无 无 无
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pCold Ⅰ pCold Ⅱ pCold Ⅲ pCold Ⅳ载 体图谱
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表达系统的选择主要取决于表达抗体的用途和抗体的 产量，而产量影响着抗体的经济效益。
如果表达的抗体属于小分子片段，无需抗体效应作用
和药物动力学活性，选用细菌表达系统就足够了。如 scFv渗透性好，免疫原性弱，可以很快从血液中清除 掉，常用与放射免疫检测和肿瘤的原位治疗。 如果表达的抗体用于治疗，需要延长抗体的药物动力
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酵母表达系统的优点： 1、具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源 蛋白的表达； 2、可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表 达的蛋白具有活性； 3、营养要求低，生长快，培养基廉价，易于操作和培养， 亦有利于工业放大生产； 4、表达量高，许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达 到g/L以上水平； 5、表达的蛋白既可存在于胞内，也可分泌到胞外。 6、糖基化程度低； 7、外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上， 这样得到的基因工程菌株比较稳定。
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一种表达体系的核心是表达载体及宿主菌，而表达方法的进步也
主要体现在载体元件的优化和宿主菌基因型的改造上。
理想的原核表达载体应具有以下特征：
（1）稳定的遗传复制和传代能力；
（2）具有显性的转化筛选标记； （3）启动子的转录是可调控的，抑制时本底转录水平较低； （4）启动子转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程 中不影响表达载体的复制； （5）具备适用于外源基因插入的酶切位点，以确保目的基因 按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
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抗体蛋白质在大肠杆菌中的表达方式：
1、融合型表达 优点：大大提高转运蛋白的溶解性，增加表达系统的稳定性， 提高中间蛋白的折叠性，减少被降解的机会，从而增加融合蛋 白在包涵体内的表达量。 不足：让中间蛋白复性需要昂贵的蛋白酶；裂解不完全会导致 产物减少；要获得有活性的蛋白，需要很多步骤才能完成；融 合蛋白的可溶性难以保证。 2、分泌型表达 在载体中引入合适的引导肽序列，可以将抗体片段引导向胞周 空间，允许抗体片段发生折叠、二硫键形成等。用这种方式生 产的抗体片段具有与完整抗体类似的亲和常数，也有利于蛋白 的富集和进一步纯化。
PET
pET-21（+）、pET-24（+）和pET-23（+） 翻译载体：包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效 核糖体结合位点，用于表达一些不带有核糖体结合 位点的目的基因
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pET 28a载体图谱
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pCold 系列表达载体
Qing 等人利用冷休克基因cspA 启动子开发了一系 列独特性的冷休克表达载体。cspA基因是当温度突然降 低时，原核生物和真核生物都会表现出冷激反应，它们会 通过合成冷激蛋白来克服冷激的不利影响。在低温下表达 重组蛋白使大肠杆菌自身蛋白质合成受到抑制，促进目的 蛋白正确折叠和提高蛋白可溶性。
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大肠杆菌表达系统
蛋 白 表 达 系 统
原核表达系统具有吸引力的原因在于它的成 本低、生产率高和能够大规模快速的生产等 优点
昆虫细胞表达系统
存在不正确的糖基化修饰，且表达量低
真 核 表 哺乳动物表达系统 达 系 统 酵母表达系统
外源基因不能持久稳定地表达，而且表达成本 很高，技术背景复杂 存在一些蛋白不能有效地折叠，发酵周期较长， 容易污染，需要考虑表达产物的卫生安全性，筛 选产物价格昂贵，有时表达产物没有生物活性等 问题都为临床生产和应用带来了不便，也存在产 物低表达或不表达的问题，产物纯化问题依然存 在
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抗体原核表达的一般操作过程：
获得目的抗体基因：PCR或RT-PCR 制备表达载体：选择表达载体要根据所表达蛋白的最终应用， 如为方便纯化，可选融合表达，如为获得天然蛋白，可选择 非融合表达。 将目的抗体基因插入表达载体中（测序验证：插入方向和可 读框应都正确） 转化表达宿主菌：抗性筛选或蓝白斑筛选 诱导靶蛋白的表达 表达蛋白的分析 纯化和进一步检测
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第二节 原核表达系统
原核表达是指通过基因克隆技术，将外源目的 基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使
其在特定原核生物或细胞内表达。人们为了获得高水
平的基因表达产物，通过综合考虑控制转录、翻译、 蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计 出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同 性质、不同要求的目的基因的需要。
pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、 Thrombin pGEX-4T-2、pGEX-4T-3 pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX- Factor Xa 5X-3 pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3 PreScission
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pGEX-4T-1载体图谱
法等理化方法及病毒感染等。
抗体在哺乳动物细胞表达系统中表达的一般操作过程： 克隆目的抗体基因（经测序验证）-准备真核表达载体-将目的
抗体基因插入表达载体中-转染-筛选-验证（PCR鉴定外源基因、
免疫印迹鉴定蛋白表达、测定scFV基因对受体细胞增殖的影响）
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昆虫细胞表达系统：能利用信号肽将外源基因分泌到胞 外，而且能有效地进行蛋白质翻译后的加工与修饰。最常 用的是杆状病毒介导的表达系统，杆状病毒属环状双链 DNA 病毒，具有严格宿主专一性，通常感染无脊椎动物。 该系统最大的优点是蛋白表达水平高（ 1-500mg/L 昆虫 细胞培养液），但对培养基的营养要求高，要求掌握熟练 的细胞培养技术。
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常用的原核表达载体分类及特征
转录载体：用以表达本身带有原核核糖体结合位 点和AUG起始密码子的目的基因
载 体
pET载体系统为满足不同的需求，生产了带有His〃Tag、 T7〃Tag、S〃Tag、GST〃Tag、ompT、CBD S〃Tag、 Thioredoxin、DsbA〃Tag 、Trx〃Tag等标签的融合蛋白，其中带 有S〃Tag、His〃Tag、T7〃Tag的蛋白易于通过蛋白质杂交检测。