人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
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12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震荡数秒， 8000rpm离心5min
小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀
55℃水浴10分钟助溶
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提取RNA
（三）、注意事项
1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。
2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗， 乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水 冲洗，晾干。
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操作步骤
（三）cNDA合成
（1）两步法RT-PCR a常用的反应体系
10×RT反应缓冲液
2ul
dNTP Mixture（各10mM） 2ul
RNAase inhibitor (40U/ul) 0.5ul
oligo (dT)18
1ul
逆转录酶
1ul
总RNA
0.5~1ug
DEPC－free水
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电泳
在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压 呈正比。因此为了获得电泳分离 DNA片段的最大分辨率，电场强 度不宜高于5V/cm。
2019/11/8
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STEPS
does matter
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染色与照相
常用荧光染料溴乙锭（EB） 染色，在紫外光下观察DNA条带， 用紫外分析仪拍照，或用凝胶成 像系统输出照片，并进行有关的 数据分析。
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操作步骤
（三）cNDA合成
（2）一步法RT-PCR
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转 录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。
人类RNA的提取、RT-PCR技术以及琼脂糖凝胶电泳
DNA降解 DNA跑出凝胶 EB染色的DNA所用光源不合适 DNA DNA跑出凝胶 分子大小相近的DNA带不易分辨 DNA变性 DNA链巨大，常规凝胶电泳不合 适。
电泳时
配胶的缓冲液与电泳的缓冲液 不是同时配制。
电泳时电压过高
同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即 可。
电泳时电压不应超过20V/cm。
二、方法
方法一：反转录-第一链cDNA合成、 PCR合成第二链 方法二：反转录-聚合酶链反应（RTPCR扩cDNA）
part 3
琼脂糖凝胶电泳 结果分析
应用
一、结果分析
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种 电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区 别是：它兼有“分子筛”和“电泳技术”的双重作 用。 所谓分子筛，就是它只允许直径比孔径小的分 子进入，因此能将混合物中的分子按大小加以筛分。 电泳，就是溶液中的带电颗粒在电场中朝着与 其自身所带电荷相反的方向移动的现象，利用这种 现象将电场中不同带电颗粒区分的方法就是电泳技 术。 以下为结果分析中常见的问题。
总RNA的提取,RT-PCR实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
人类DNA、RNA提取、核酸内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR
PCR基本步骤：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单 链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模 板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退 火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。
人类基因组DNA提取
3．加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，2000rpm离 心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 • 4.小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分 钟，室温2000rpm离心5分钟。 • 5.小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯 仿再抽提一次。
人类基因组DNA提取
• 6.将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶 液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混 和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸 头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室 温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100 μl TE中，测OD 值。 • 7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长 期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
注意事项
•
人类基因组DNA提取
1.酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开時 ，可加入适量STE稀释，然后再用酚抽提。 • 2.保温可在45~55℃范围内进行。 • 3.真核生物的DNA分子很大，机械张力极易引起 DNA分子的断裂，因此抽提DNA时动作不可过猛； 溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗 口径滴管，以防机械力（震动）将DNA分子打得太 碎。
RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳原理与结果
实验原理
PCR是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR按照底 物（即模板DNA）的来源和引物的特点可分为经典PCR、 逆转录PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中， RT-PCR较常用。在这个反应体系中，被检物为RNA，如 mRNA，需借助逆转录酶的逆转录作用，转变为相应的互 补链DNA（cDNA）才能进行PCR。为此，逆转录和PCR 分两步进行，先作逆转录获得cDNA，再以此为模板作 PCR。
RT-PCR反应体系
Volume(µl) 8(1µg) 4 2 1 0.4 1.0 Components R.T.Product 10xPCR buffer MgCl2(25mmol/L) Volume(µ l 5.0 2.5 2.5
Primer1
Primer2 Taq DNA polymerase ddH2O Total
琼脂糖凝胶电泳的操作过程
用移液器吸取PCR产物10μl于封口膜上，再 加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心 加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至50-100V，可 见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳 约30min-60min。
将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯， 可见到发出荧光的DNA条带。
琼脂糖凝胶电泳的操作过程
1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液 中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全 溶解。（冷却到60℃，加入5μl的goldview， 并摇匀。） 装好制胶板，插入适当梳子，将溶解的琼 脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将 凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液 至液面覆盖凝胶1-2mm。
琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法， 琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体 基质的特性，利用电荷效应，在电场的作用下及 中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极
DNA,RNA提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,PCR技术,限制性内切酶简介
二、概念
核酸酶：催化核酸酯键的水解 核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3’端或5’ 端）逐个水解下核苷酸 核酸内切酶：从核酸分子内部切断3’,5’-磷酸 二酯键 限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能 识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶
三、限制性核酸内切酶的分类
1、第一型（Type I）： 既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基 化的DNA的水解； 2、第二型（Type II）： 只催化非甲基化的DNA的水解，其切割位 点可知、固定是，是最常用的限制性核酸内切酶； 3、第三型（Type III）： 同时具有修饰及认知切割的作用
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖 的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留 在溶液里 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞 膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易 去除
SDS法流程图 （以动物组织为例）
其它方法
浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同， 将二者分离
有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时 抑制核酸酶的降解作用
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
人类细胞质RNA提取RTPCR的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
提取RNA
（一）、准备试剂
• 氯仿 • 异丙醇 • 75℅乙醇 • 无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处 理过的水配制)
2018/11/30
提取RNA
（二）、操作步骤
取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（
4000rpm 5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清
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RT-PCR的原理、方法
实验原理
1、单拷贝基因表达存在逐步放大 机制。 2、PCR技术，即聚合酶链式反应。 反应分三步：变性，退火，延伸。 3、逆转录酶。可以以RNA为模板合 成cDNA第一条链，或者以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA。
可见，RT-PCR是一种将cDNA 合成与PCR技术结合分析基因表达 的快速灵敏的方法。
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操作步骤
（三）cNDA合成 （1）两步法RT-PCR b操作
在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul 总RNA溶液 ↓ 0.2ml Ep管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中
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实验原理
Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍 (GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促 使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。 加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促 使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相 中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水 相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的 总RNA。
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incipe
does matter
pr
RNA 模板
逆转录酶
DNA-RNA 杂化双 链
RNase降解RNA
总RNA的提取-电泳鉴定及RT-PCR
— PCR产物的电泳
— 结果观察与分析
— PCR产物回收
实验操作一、建立 PCR 反应体系
1. 取 1 支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中， 用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂： 1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 l 2）加入下列试剂,，顺序可以改变
实验操作五、PCR产物的回收
挤胶法回收PCR产物：
PCR电泳结果
Marker 1 2
（ 1 ）在 UV 灯下，用手术刀片 将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶切 下，放入封口膜中；
2000bp 1000bp 750bp 500bp
（2）将切下来的胶块，标记好 姓名，-20℃冰箱中 。 （3）放在封口膜内直接挤压， 用加样器吸取挤压后得到的液 体。
RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留， 容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成 RNA不溶解的主要原因 。
判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过 分干燥是逆转录成功的关键环节。
RNA pellet：透明胶样 干燥后应该无色透明
12） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加到RNA 上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心 充分，一定要用加样器反复多次吹打方 可。但由于溶液体积非常小，要避免出 现气泡影响RNA的溶解。
5)加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s， 室温放置5 min （此期间液体开始分层，不 要轻易搅动液体）。
6)10000 rpm， 离心 5 min
Protein
RNA (清澈透明) DNA
7)将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。
DNA,RNA提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,PCR技术,限制性内切酶简介详解
意义：
1、便于连接：只要粘性末端互补就可以连接； 2、5’端标记：凸出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶进 32 P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶 添加几个多 聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端； 3、补平成平齐末端：在DNA聚合酶的作用下补齐末端
消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切
限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。
徐师大-屈艾老师制作 43
4、DNA的分子结构
DNA 分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也 有很大的影响。 某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒 DNA 或病毒 DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍， 最高的可达20倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自 己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差 别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份
分子生物学讨论
PART 1
• 1.DNA提取的原理和方法
• 2.限制性核酸内切酶切割的原理和方法 • 3.DNA琼脂糖凝胶电泳结果和分析及其应
人类基因组DNA提取
主要内容
1、基因组DNA
CTAB法 SDS法 其它方法
2、质粒DNA
碱裂解法
煮沸法
3、细胞器DNA
差速离心法
基因组DNA
CTAB法
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六、识别序列
• 识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
• 回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文 序列。 • 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种， 它们都呈回文结构。
徐师大-屈艾老师制作
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七、 切割类型
检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制 酶的作用所造成的 DNA 分子的切割类型，通常是属 于下述两种排列方式之一：
分子生物学第一次讨论人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，在
SDS中稳定。水解各种蛋白质（包括糖蛋 白和肽类，和脂类，胺类物质）。同时 由于 RNA 酶和 DNA 酶是蛋白质，也可被水 解，从而防止DNA被水解。
酚是蛋白质的变性剂，并将变性的蛋白质溶解其中。而
图1就是加有荧光染色剂的样品在紫外光 下拍摄的照片。将实验样品与DNA标准样 品同时电泳，比对2者的条带位置，就可 以鉴定分离出的DNA的分子量或构型。
琼脂糖凝胶电泳可以： （1）用于DNA切胶回收；（2）用于 DNA分离；（3）用于佐证DNA是否重组、 质粒等是否切开以及其他分子生物学 研究。
电泳是如何实现分离DNA的
电泳实验过程通常包含4个环节。将琼 脂糖在水中加热到90℃以上使其溶解后， 趁热倒入制胶板中，让它在室温下自然 凝固，形成半固体状的无色透明凝胶片。 这一步称为制胶。
制胶板中事前插有梳子，当凝胶形成后，移 去梳子，胶片中就留下了小孔。将这样的凝 胶片放人电泳槽(图7)，加入电泳液后，向小 孔中加入待分离的DNA样品。 这一步称为点样，通 常的点样量只有几个 微升。接通电源，在 电场的作用下，DNA 分子在凝胶的孔隙中 向正极移动，这就是 电泳。
并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入 到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时， 蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀，从而被 除去。
相关试剂及作用 细胞裂解液 :82.9g NH4CL，
10gKHCO3，0.37gEDTA·NA2, 灭菌双蒸水定容至1000mL EDTA·NA2是一种血液抗凝剂 低渗溶液使细胞膜涨破，白细胞释放细胞核，红细胞释放血 红蛋白
细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达
实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨合殷悦涵实验日期：2021.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白〔RNP〕的形式存在。
别离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质别离，然后将RNA同其他的细胞成分别离开并保证RNA的完整性。
Trizol法别离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节防止它的污染。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。
2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过屡次循环是模板上特定DNA 拷贝数呈指数级增长。
根本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。
RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞〔A549和H1299〕中的表达水平。
二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549〔野生型〕和H1299〔p53缺失型〕、p53引物、GAPDH 引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温枯燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定〔一〕RNA提取取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心15min分层→取上层水相入新的Ep管中参加等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min →4℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀→弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀→4℃，12000rpm离心5min→弃上清，晾干，用30μl无RNase水溶解沉淀〔二〕RNA浓度和纯度测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达〔一〕反转录合成cDNA1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管参加样品RNA2μg，以无水RNase水补足体积至9μl，70℃，10min，立即置于冰上。
人类细胞质RNA提取RTPCR的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用共45页文档
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
用
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
人类细胞质RNA提取RTPCR的原理
方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
RNA 的提取琼脂糖电泳及RTPCR
RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制 作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。
使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。
有效浓度：0.05%---0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。
RNA (清澈透明) DNA
离心10分钟时—课间休息
8）沉淀RNA：加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000rpm，4C，(统一) 离心10 min，弃上清。
10）加1ml 75%乙醇洗涤。
注意：
75%乙醇的作用： 不起沉淀作用，只是为了清洗管壁
加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧 缓慢加入，不要搅动沉淀
室温孵育10 min 结束
5）加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）
10, 000 rpm，离心 5 min (统一离心)
7）将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。
Protein
RNA (清澈透明) DNA
• RNA提取:
Protein
发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。
室温孵育10 min
课间介绍 RNA提取的几种方法
1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时
，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步 抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。
特点：需低温操作，但价格经济。
在Tris溶液中半衰期为1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。
RNA-的提取琼脂糖电泳及RTPCRPPT课件
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如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？
根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小
于500bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采 用2分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延 伸时间2-3分钟。
变性 温度一般选用941oC，变性时间可根据
模板大小和浓度确定，一般采用30秒。
退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时
1）Taq DNA聚合酶的特性: 半衰期：95oC ，40分钟 活 性：5`--3`方向的聚合酶活性。
5`--3`外切酶活性。 缺乏3`--5`外切酶活性。 因此没有校正功能。
大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt
小亚基40S: 18S=1874nt
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（8：15~9：05）
•第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA
1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。 2）实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过 大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3）将研磨后的组织（小米粒大小）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞 充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4）室温孵育10 min。
1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐
RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制 作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。
使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。
有效浓度：0.05%---0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。
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STEPS
does matter
2014-12-19
样品配制与加样
DNA样品用适量Tris-EDTA缓 冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴 酚蓝或其他指示染料，含有10%15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加 其比重，使样品集中。
STEPS
does matter
2014-12-19
电泳
在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压 呈正比。因此为了获得电泳分离 DNA片段的最大分辨率，电场强 度不宜高于5V/cm。
2014-12-19
实验前的准备
RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污 染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多 种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等， 只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解 ，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接 影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA 酶的环境对于制备RNA很重要。
incipe
1.5
2.0
3-0.2 2-0.05
does matter
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pr
选择电泳类型 选择电泳缓 冲体系
染色和照相
电泳
琼脂糖凝胶 的制备
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样品的制备 与加样
选择电泳类型
STEPS
does matter
用于分离核酸的琼脂糖凝 胶电泳可分为垂直型及水平型 （平板型）。
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实验原理
Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍 (GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促 使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。 加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促 使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相 中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水 相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的 总RNA。
RNA
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主要内容
◆人类细胞质RNA提取 ◆RT-PCR的原理、方法 ◆琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
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人类细胞质RNA提取
提取总RNA
电泳
合成cDNA第 一链
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PCR
真核细胞RNA的种类
真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、 tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（15%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细 胞质中。 大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多 聚A(Poly A)尾巴。
实验原理
1、琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂 琼脂糖浓度与 DNA分离范围 糖束→大网孔型凝胶 ——分离、 1.0 1.2 琼脂糖浓度 鉴定、纯化 DNA /% 0.5 0.7 线状DNA 大小/kb 30-1 120.8 分 10-0.5 7-0.4 2、影响DNA 迁移率的因素： DNA 子的大小、构象，凝胶浓度，电 压，电泳缓冲液的组成
2014-12-19
提取RNA
（一）、准备试剂
• 氯仿 • 异丙醇 • 75℅乙醇 • 无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处 理过的水配制)
2014-12-19
提取RNA
（二）、操作步骤
取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（
4000rpm 5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清
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操作步骤
（二） RNA的提取
2014-12-19
操作步骤
（二） RNA的提取
2014-12-19
操作步骤
（三）cNDA合成
（1）两步法RT-PCR a常用的反应体系
10×RT反应缓冲液 2ul dNTP Mixture（各10mM） 2ul RNAase inhibitor (40U/ul) 0.5ul oligo (dT)18 1ul 逆转录酶 1ul 总RNA 0.5~1ug DEPC－free水 补足体系至20ul
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常用的RNA酶抑制剂
1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失 活，有高致癌性。（实验准备阶段使用） 2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使 RNA酶失活。 3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠 肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合 成cDNA阶段使用）
2014-12-19
RNA保存
溶解在无RNase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存 时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。 从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需 溶解在去离子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使 用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟 ，70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问题 原因 DNA上样量不够 DNA降解 DNA跑出凝胶 对策 增加DNA上样量，聚丙烯酰胺 凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高 ，上样量可适当降低。 实验过程中应避免核酸酶污染。 缩短电泳时间，降低电压，增加 凝胶浓度。
带弱或无 DNA带
EB染色的DNA所用光源 应用短波长（254nm）的紫外光 不合适 源。
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结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问题 原因 出现片状拖 酶量多或者酶的质量差， 带或涂抹带 dNTP浓度高，Mg2+浓度 高，退火温度过低，循环 次数多。 电泳条件不合适 不规则DNA 带迁移 DNA变性
2014-12-19
对策 减少酶量或更换酶，减少dNTP浓 度，适当降低Mg2+浓度，增加模 板量，减少循环次数。
2014-12-19
操作步骤
（六） 产物的电泳和结果的测定
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不 同长度产物所需凝胶浓度）。 取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点 样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电 泳45－60min。成像系统成像分析。
2014-12-19
琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
· • • 0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP (每种) 0.5umol／L 基因特异引物（上下游）
•
• •
200 U
AMV逆转录酶
1×Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmol／L MgCI2
•
•
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1 mmo1／L DTT
电泳时电压不应超过20V/cm，温 度<30℃，巨大DNA链电泳， 温 度<15℃，检查所用电泳缓冲液的 缓冲能力，注意经常更换。 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀释DNA。
沉淀中加入1ml TRIzol ，旋涡震荡10 s 重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转
移至1.5ml EP管，15~30℃放置5min
加入0.2 ml氯仿，用手摇晃15 s，15~30℃放置5min
12000rpm离心15min
2014-12-19
提取RNA
（二）、操作步骤
小心吸取上清，转移至新的1.5ml Ep管，加入等体积的异丙醇，15~30℃
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逆转录酶
DNA-RNA 杂化双 链
RNase降解RNA
Taq酶
RT-PCR
单链DNA
DNA聚合酶
cDNA
操作步骤
（一） 引物设计
1、引物的特异性决定PCR反应特异性。 2、引物设计原则的把握：
（1）引物长度:一般为15～30bp （2）碱基分布 （3）3‘端要求 （4）引物自身二级结构 （5）引物之间的二级结构 （6）同源序列 （7）5’端无严格限制
操作步骤
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转 录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。 优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余 污染；可以得到更高的灵敏度。 缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重 新提取总RNA。
2014-12-19
操作步骤
常见问题 原因 DNA跑出凝胶 分子大小相近的DNA带 不易分辨 DNA变性 对策 缩短电泳时间，降低电压，增加 凝胶浓度。 增加电泳时间，核准正确凝胶浓 度 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀 释DNA。 在脉冲凝胶电泳上个分析。
DNA带缺 尖
2014-12-19
DNA链巨大，常规凝胶 电泳不合适。
2014-12-19
RT-PCR的原理、方法
实验原理
1、单拷贝基因表达存在逐步放大 机制。 2、PCR技术，即聚合酶链式反应。 反应分三步：变性，退火，延伸。 3、逆转录酶。可以以RNA为模板合 成cDNA第一条链，或者以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA。
可见，RT-PCR是一种将cDNA 合成与PCR技术结合分析基因表达 的快速灵敏的方法。
2014-12-19
操作步骤
（三）cNDA合成 （1）两步法RT-PCR b操作
在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul 总RNA溶液 ↓ 0.2ml Ep管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中
↓
42℃ 30min（合成cDNA第一链）
85℃ 5min（灭活逆转录酶）
2014-12-19
STEPS
does matter
2014-12-19
染色与照相
常用荧光染料溴乙锭（EB） 染色，在紫外光下观察DNA条带， 用紫外分析仪拍照，或用凝胶成 像系统输出照片，并进行有关的 数据分析。
STEPS
does matter
2014-12-19
结果分析
（一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素