人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用

STEPS
does matter
2014-12-19
样品配制与加样
DNA样品用适量Tris-EDTA缓 冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴 酚蓝或其他指示染料，含有10%15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加 其比重，使样品集中。
STEPS
does matter
2014-12-19
电泳
在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压 呈正比。因此为了获得电泳分离 DNA片段的最大分辨率，电场强 度不宜高于5V/cm。
2014-12-19
选择缓冲液系统
STEPS
does matter
常用的电泳缓冲液有EDTA （pH8.0）和Tris-乙酸（TAE）， Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE） 等，浓度约为50mmol/L (pH7.5~7.8)。
2014-12-19
凝胶的制备
以稀释的电泳缓冲液为溶剂， 用微波炉配制一定浓度的溶胶， 灌入水平胶框或垂直胶膜，插入 梳子，自然冷却。
2014-12-19
操作步骤
（六） 产物的电泳和结果的测定
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不 同长度产物所需凝胶浓度）。 取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点 样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电 泳45－60min。成像系统成像分析。
2014-12-19
琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
2014-12-19
incipe
does matter
pr
RNA 模板
逆转录酶
DNA-RNA 杂化双 链
RNase降解RNA
Taq酶
RT-PCR
单链DNA
DNA聚合酶
cDNA
操作步骤
（一） 引物设计
1、引物的特异性决定PCR反应特异性。 2、引物设计原则的把握：
（1）引物长度:一般为15～30bp （2）碱基分布 （3）3‘端要求 （4）引物自身二级结构 （5）引物之间的二级结构 （6）同源序列 （7）5’端无严格限制
2014-12-19
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问题 原因 出现片状拖 酶量多或者酶的质量差， 带或涂抹带 dNTP浓度高，Mg2+浓度 高，退火温度过低，循环 次数多。 电泳条件不合适 不规则DNA 带迁移 DNA变性
2014-12-19
对策 减少酶量或更换酶，减少dNTP浓 度，适当降低Mg2+浓度，增加模 板量，减少循环次数。
2014-12-19
提取RNA
（三）、注意事项
6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 7、防止RNA酶污染 （1）RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌 等 （2）严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操 作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻 璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污 染。 （3）最大限度地抑制内源性的RNA酶；而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的RNA酶。
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问题 原因 DNA上样量不够 DNA降解 DNA跑出凝胶 对策 增加DNA上样量，聚丙烯酰胺 凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高 ，上样量可适当降低。 实验过程中应避免核酸酶污染。 缩短电泳时间，降低电压，增加 凝胶浓度。
带弱或无 DNA带
EB染色的DNA所用光源 应用短波长（254nm）的紫外光 不合适 源。
2014-12-19
实验前的准备
RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污 染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多 种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等， 只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解 ，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接 影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA 酶的环境对于制备RNA很重要。
2014-12-19
RNA保存
溶解在无RNase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存 时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。 从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需 溶解在去离子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使 用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟 ，70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。
常见问题 原因 DNA跑出凝胶 分子大小相近的DNA带 不易分辨 DNA变性 对策 缩短电泳时间，降低电压，增加 凝胶浓度。 增加电泳时间，核准正确凝胶浓 度 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀 释DNA。 在脉冲凝胶电泳上个分析。
DNA带缺 尖
2014-12-19
DNA链巨大，常规凝胶 电泳不合适。
STEPS
does matter
2014-12-19
染色与照相
常用荧光染料溴乙锭（EB） 染色，在紫外光下观察DNA条带， 用紫外分析仪拍照，或用凝胶成 像系统输出照片，并进行有关的 数据分析。
STEPS
does matter
2014-12-19
结果分析
（一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素
• DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移 距离与其分子量的对数成反比； • 琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同 浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同； • DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖 凝胶中的电泳速度差别较大
2014-12-19
常用的RNA酶抑制剂
1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失 活，有高致癌性。（实验准备阶段使用） 2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使 RNA酶失活。 3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠 肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合 成cDNA阶段使用）
2014-12-19
操作步骤
（二） RNA的提取
2014-12-19
操作步骤
（二） RNA的提取
2014-12-19
操作步骤
（三）cNDA合成
（1）两步法RT-PCR a常用的反应体系
10×RT反应缓冲液 2ul dNTP Mixture（各10mM） 2ul RNAase inhibitor (40U/ul) 0.5ul oligo (dT)18 1ul 逆转录酶 1ul 总RNA 0.5~1ug DEPC－free水 补足体系至20ul
2014-12-19
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问 原因 题 对策
配胶的缓冲液与 同时配制，电泳缓冲 电泳的缓冲液不 液高出胶的1-2mm即 可。 电泳时 是同时配制。 ladder扭 电泳时电压过高 电泳时电压不应超过 曲 20V/cm。
2014-12-19
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
2014-12-19
提取RNA
（一）、准备试剂
• 氯仿 • 异丙醇 • 75℅乙醇 • 无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处 理过的水配制)
2014-12-19
提取RNA
（二）、操作步骤
取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（
4000rpm 5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
· • • 0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP (每种) 0.5umol／L 基因特异引物（上下游）
•
• •
200 U
AMV逆转录酶
1×Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmol／L MgCI2
•
•
2014-12-19
1 mmo1／L DTT
实验原理
1、琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂 琼脂糖浓度与 DNA分离范围 糖束→大网孔型凝胶 ——分离、 1.0 1.2 琼脂糖浓度 鉴定、纯化 DNA /% 0.5 0.7 线状DNA 大小/kb 30-1 120.8 分 10-0.5 7-0.4 2、影响DNA 迁移率的因素： DNA 子的大小、构象，凝胶浓度，电 压，电泳缓冲液的组成
放置10min
12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震荡数秒，
8000rpm离心5min
小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀
2014-12-19
55℃水浴10分钟助溶
提取RNA
（三）、注意事项
1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗， 乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水 冲洗，晾干。 3、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更 长时间。 4、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然 后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当 用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要 勤换。
2014-12-19
操作步骤
（三）cNDA合成 （1）两步法RT-PCR b操作
在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul 总RNA溶液 ↓ 0.2ml Ep管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中
↓
42℃ 30min（合成cDNA第一链）
85℃ 5min（灭活逆转录酶）
2014-12-19
2014-12-19
RT-PCR的原理、方法
实验原理
1、单拷贝基因表达存在逐步放大 机制。 2、PCR技术，即聚合酶链式反应。 反应分三步：变性，退火，延伸。 3、逆转录酶。可以以RNA为模板合 成cDNA第一条链，或者以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA。
可见，RT-PCR是一种将cDNA 合成与PCR技术结合分析基因表达 的快速灵敏的方法。
沉淀中加入1ml TRIzol ，旋涡震荡10 s 重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转
移至1.5ml EP管，15~30℃放置5min
加入0.2 ml氯仿，用手摇晃15 s，15~30℃放置5min
12000rpm离心15min
2014-12-19
提取RNA
（二）、操作步骤
小心吸取上清，转移至新的1.5ml Ep管，加入等体积的异丙醇，15~30℃
2014-12-19
实验原理
Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍 (GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促 使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。 加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促 使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相 中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水 相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的 总RNA。
操作步骤
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转 录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。 优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余 污染；可以得到更高的灵敏度。 缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重 新提取总RNA。
2014-12-19
操作步骤
电泳时电压不应超过20V/cm，温 度<30℃，巨大DNA链电泳， 温 度<15℃，检查所用电泳缓冲液的 缓冲能力，注意经常更换。 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀释DNA。
RNA
2014-12-19
主要内容
◆人类细胞质RNA提取 ◆RT-PCR的原理、方法 ◆琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
2014-12-19
人类细胞质RNA提取
提取总RNA
电泳
合Baidu NhomakorabeacDNA第 一链
2014-12-19
PCR
真核细胞RNA的种类
真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、 tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（15%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细 胞质中。 大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多 聚A(Poly A)尾巴。
1.5U Taq聚台酶 终体积为50ul。
操作步骤
（四）PCR扩增
（1）50ulPCR体系的组成（即一步法）：
2014-12-19
操作步骤
（四）PCR扩增 （2）PCR反应过程：
2014-12-19
操作步骤
（五） PCR条件的优化
（1）引物退火温度的调节，一般在引物设计软件 推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。 （2）此外Mg2＋ 浓度的调节也非常重要，通常最 佳浓度为2mM左 右。 （3）引物和模板的量等。
incipe
1.5
2.0
3-0.2 2-0.05
does matter
2014-12-19
pr
选择电泳类型 选择电泳缓 冲体系
染色和照相
电泳
琼脂糖凝胶 的制备
2014-12-19
样品的制备 与加样
选择电泳类型
STEPS
does matter
用于分离核酸的琼脂糖凝 胶电泳可分为垂直型及水平型 （平板型）。