蛋白质定位

pH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白 大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
Western Blot
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
Western Blot
灌制积层胶
插入梳子
Western Blot
Staking gel
Separating gel
Western Blot
差速离心法


其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与 沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是： ①分离效果差，不能一次得到纯颗粒； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
Western Blot
蛋白质定位
蛋白质的亚细胞定位常用方法： 差速离心、密度梯度离心法；免疫胶体 金标记；免疫荧光；免疫印迹法；与GFP 构建融合基因表达融合蛋白；
Western Blot
细胞器的分离技术

离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据 物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同， 而使物质分离的分离分析技术。

蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
/thread-23639-1-1.html
Western Blot
蛋白样品的变性

2×SDS-PAGE上样缓冲液：
1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT SDS 甘油 溴酚蓝 总体积 10 ml 20 ml 4g 20 ml 0.2 g 100ml

2.线粒体的分离 •线粒体普遍存在于真核细胞中，它是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内 进行氧化所产生的能，线粒体的分离主要靠差速分离。 3.线粒体膜分离 •线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心 4.聚核糖体的分离 •核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在 细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，一般用差速离心法可分离出 聚核糖体。 5.微粒体分离 •微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离 心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。
/bio101/2008/21461_2.htm



Western Blot
免疫印迹法和差速离心法研究蛋白质定位

免疫印迹法（immunoblotting test,IBT),也被称为 蛋白质印迹法（Western blotting)。对已知蛋白质的 表达，可用一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通 过构建融合蛋白，对所带标签的抗体进行检测。差速离 心法是交替使用低速和高速进行离心，用不同强度离心 力使不同质量的物质分级分离的方法，尤其适用于混合 样品中沉降系数差别较大组分的分离。差速离心法结合 蛋白质印迹法，可观察到蛋白质在各亚细胞结构中的分 布，这也是目前比较常用的、比较准确的蛋白质定位研 究方法。
第三章蛋白质定位的方法
第二节细胞器分离结合免疫印 迹法定位蛋白
Western Blot
本节课的主要内容


蛋白质的定位 细胞器的分离 免疫印迹法 具体的实验实例
Western Blot
蛋白质定位





无论原核还是真核细胞都有一个高度有序的结构，新生的蛋白质都 要被准确的运送到细胞的各个部分，如溶酶体、线粒体、叶绿体、 细胞质和细胞核等，以更新其结构组成和维持其功能，这一过程称 为蛋白质的定位。 真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。 真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在 胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并 行使功能。 细胞根据蛋白质是否携带分选信号以及分选信号的特征，选择性地 将各种蛋白质送到细胞不同部位。根据蛋白分子定位信号，可引导 蛋白质在胞内定位。 细胞内蛋白质的分选和运输对于维持细胞的正常结构与功能、完成 各种生命活动非常重要，在许多情况下，蛋白质的异常转位与细胞 的病例变化密切相关。
蛋白质免疫印迹技术及
常见问题分析
Western Blot

Western Blot简介

Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

Western Blot
Western Blot 简介：

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
Western Blot
转膜

要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。

Western Blot
转移膜的选择

最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜， 此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白 印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于 核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍：
Western Blot
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。

Western Blot
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可 以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级 和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫
键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链 形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
Western Blot
凝胶成分



丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Western Blot
凝胶浓度与蛋白分离范围
蛋白分子量（KDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 凝胶浓度（%） 20 15 12.5 10
25-200
8
SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：/thread-20726-1-1.html
Western Blot
不连续电泳：
作用
浓缩胶
分离胶
缓冲液PH
pH6.8Tris-Cl
Hale Waihona Puke 凝胶浓度低，2-5%
使蛋白样品浓缩
使蛋白样品分离
Western Blot
蛋白样品的变性
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位） ，因此， 为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之 打开折叠的空间结构， 蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS的上样buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸 5 分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 分钟，标 准的上样buffer 称为2X Laemmli buffer，上样时与样本1：1混 合后变性上样即可
Western Blot
部分细胞器的分离方法
一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。 1.细胞膜的分离 •细胞膜又称质膜，分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说，红细胞膜与线粒体膜的制 备用差速离心法即可，其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同，采用梯度离心后，分布于指 定区域，可分离得到纯制品
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O

DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。

按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
Western Blot 优点

高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应
1-5ng中等大小的靶蛋白
Western Blot
Western Blot应用

目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
Western Blot
Western Blot 流程

蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取

蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和
检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！

使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特 定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等， 可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试 剂盒进行抽提。
Western Blot
Western Blot 基本原理

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将 蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分 离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一 抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
Western Blot

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC
膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，
对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western Blot
密度梯度离心法
该法的优点是：
①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能 分离有一定浮力密度的颗粒； ③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成 的区带由于对流而引起混合。 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严 格，不宜掌握。

细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结 构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在 同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯 度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器
差速离心：
采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
大颗粒首先沉到管底
一般实际用的比较多的是 RIPA裂解液，样品提取以“快速彻底裂解， 先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，然后取 出部分蛋白定量，其余加入上样缓冲液 100℃充分变性，再分装保存 于-20℃ 。

Western Blot
Western Blot
蛋白样品的定量

目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
较小颗粒沉降
细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物 酶体、内质网与高基体、核蛋白体。
密度梯度离心法：
预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯 度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。
注：待分离颗粒密度比介质密度都要大：
不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部