细胞实验讲解

细胞通透
常用通透剂及其原理
通透剂
Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织 化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通 透剂，在膜上打孔。
作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质 而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为 推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内不相应抗原结合。
细胞转染
步骤
C液 无抗生物素
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞转染
转染质粒
pcDNA3.1 （-） 空载体 pcDNA3.1（ -） -P53 重组载体
免疫荧光
pEGFP-C1 空载体
转染效率检测
实验原理
细胞免疫荧光
利用抗原与抗体特异性结合原理及特殊的荧 光素标记技术，对细胞内的特定抗原进行定位、 定量分析的一门技术。
细胞爬片
玻片处理 泡酸+清洗+晾干+高压灭菌+烘干
多聚赖氨酸/层黏蛋白处理 细胞数量
单层细胞密度达到70%左右 细胞铺板
细胞的固定
注意事项
【固定的定义】 将新鲜的活体组织或细胞，立即加入固定液中，以此使细胞保持原有形态、结构 的一种方法。
【固定的意义】
1、组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，原位保存抗原，避免 抗原失活或弥散。 2、停止细胞中的生化反应，固定其中的各种生化物质状态，防止细胞死亡后出现 自溶分解。 3、使细胞中蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前形态。 4、固定细胞形态，防止其变形或破裂。 5、使组织内各种物质产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 6、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。
分类
优点
缺点
应用
简单易行 直接免疫荧光
特异性高
快速方便
灵敏度低 成本高
多重荧光标记实验 大量样本的常规检测
灵敏度高 间接免疫荧光
成本低
步骤相对繁琐
应用广泛
难点
多重荧光标记实验
（1）单荧光素标记+荧光蛋白（GFP等）
（2）直接标记法：不同荧光素标记的一 抗
（3）间接标记法：不同种属来源的一抗 +不同荧光素标记的二抗
一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料
最常用的细胞核荧光染料
细胞免疫荧光实验步骤
细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%） 细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等） 细胞膜穿透（ Triton X-100 等） 封闭（1%BSA-PBS等） 一抗孵育 荧光二抗孵育 核复染（DAPI染色） 封片荧光显微镜拍照
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班 细胞实验讲解
讲解人：程小艳 20151205
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞 活力测定
细胞
细胞
克隆形成
细胞
划痕
接技种术
细胞 转染
细胞 免疫荧光
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞接种
按照预实验摸索好的细胞数目，将处 于对数生长期的细胞均匀种入细胞培养板 中的过程。
HFF-1细胞划痕愈合
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞划痕愈合
步骤
细胞接种
细胞划痕
用10 uL移液枪枪头在单 层细胞上呈“一”字划痕
拍照记录划痕 愈合过程
数据分析
细胞培养与细胞生物学常用技术学习班之：
软琼脂糖克隆形成
原理 将细胞消化成单细
胞，并利用上下两层软 琼脂糖凝胶模拟体内细 胞所处的半固体状态， 检测细胞在处于不贴壁 及单细胞状态时的克隆 形成能力。
细胞免疫荧光原理示意图
激光源
丌同颜色的 荧光
抗 体
抗原
细
胞
特异荧光的位置及强度
荧光素
抗原的表达位置及水平
分类
细胞免疫荧光
根据实验目的分为:
目的抗原数目
难 度
单染
越
大
， 使
双染
用
越
少
多染
分类
细胞免疫荧光
根据实验方法分为两类:
荧光素标记位置
直接免疫荧光
间接免疫荧光
实验原理示意图
比较
细胞免疫荧光
常用浓度：0.2%-0.5%
荧光素
细胞免疫荧光
在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中不免疫球蛋白的自由氨基经 碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。
一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子
荧光素
细胞免疫荧光
细胞免疫荧光
荧光染料
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)
检测肿瘤细胞恶性程度较为准确的标志之一
细胞培养与细胞生物学常用技术学习班之：
软琼脂糖克隆形成
步骤 Soft agar配置 （1.2%&0.7%）
2 ×Medium配置
1.2% Soft agar + 2 × Medium
铺下层凝胶
单细胞悬液制备
0.7% Soft agar + 2 × Medium+单细胞悬液
细胞培养 及收集
细胞铺板
细胞计数 及Biblioteka Baidu释
相同点
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞接种
细胞技术 接种数目 细胞培养板 接种体积 细胞终浓度 （个/孔） /细胞培养皿 (ml) （个/ml）
细胞活力 2000
96孔板
0.1
测定
细胞划痕 60万
30mm直径
1
细胞培养皿
细胞转染 40万
6孔板
2
细胞免疫
铺上层凝胶
克隆形成 （2~3周）
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞转染
原理
是将外源 DNA 或 RNA 导入真核细胞的 技术。常用的脂质体 转染法，是利用带正 电的脂质体与核酸带 负电的磷酸基团形成 复合物， 沉积于细胞 表面， 通过内吞作用 进入细胞。
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
荧光
细胞克隆 1000
6孔板
1
形成
2×104 6×105 2×105
1×104
异同点
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞活力测定
原理
活细胞
MTT
琥珀酸脱氢酶
甲瓒 （蓝紫色）
A490
HEPG2细胞增殖检测
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞活力测定
步骤
细胞接种
细胞荷药
加入MTT
加入DMSO
A490检测
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞接种
取出HEPG2细胞 吸弃培养基
PBS缓冲液清洗（两次） 加入胰酶消化细胞
吸弃胰酶 加入培养基重悬细胞
离心收集细胞
之： 细胞培养与细胞生物学常用技术学习班
细胞划痕愈合
原理
在融合的单层细胞上人为制造一个空白区 域（称为“划痕”），记录划痕两边的细胞进 入空白区域使“划痕”愈合的过程，以此检测 细胞迁移运动与修复能力的方法。