第10章-基因工程的操作过程

二、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目内的维基持因 和进 的入 过内 程受稳，体定并细且胞在表达受体细胞
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——氯化钙法（感受 态细胞）
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
标记基因：为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因， 从而筛选出有目的基因的 受体细胞。
启动子 目的基因
表达载体
终止子
复制原点 标记基因
来自百度文库
表达载体的模式图
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因 和复制原点两部分片段。表达载体在载体基础 上增加了 目的基、因 启、动子 终止三子部分 结构 ②用到的工具酶：既用到 限制酶 切割载体， 又用到 连接酶 将目的基因和载体拼接， 两种酶作用的化学键都是 磷酸二酯键 。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
③转化过程:
质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 染色
表达
新 性 状
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体打入受 体细胞中，使目的基 因与其整合并表达的 方法。
（3）花粉通道法 适用于被子植物
第十章 基因工程的操作过程
第一节、表达载体的构建及导 入
目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并 且可以遗传给下一代。 ②使目的基因能够表达和发挥作用。
一、表达载体的构建 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次 失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插 入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中， 结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启 动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵， 长成的棉花植株还是没有抗虫能力。 科学家又在有启动子、抗虫基因的质 粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉
表 b、启动子 达 c、终止子 载 体 d、标记基因
e、复制原点
启动子 目的基因
表达载体
终止子
复制原点 标记基因
表达载体的模式图
启动子：位于基因的首端的一段特殊的片断，它是聚合 酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出，最 终获得蛋白质。
终止子：位于基因的尾端 的一段特殊的片断，能终 止转录。
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的 什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做 成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白 基因等。
2、过程:
质粒
分子
同一种 限制酶处理
一个 切口 两个 黏性末端
两个 切口 获得目的基因
连接酶 重组（重组质粒）
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
柱头
雌 蕊 花柱
胚珠 子房
子房壁
花药
雄 蕊
花丝
子房的结构
子房壁
珠被 珠心
胚
（胚囊）
珠
极核
卵细胞
滴加目的基因溶液
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发 后，花粉管要穿过花柱直通 胚囊。花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形成的花 粉管还未愈合前，剪去柱头， 然后，滴加（含目的基因）， 使目的基因借助花粉管通道 进入受体细胞。
（1）农杆菌转化法
①农杆菌：
植物的受伤组织会产生一些糖 类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受 伤组织集中 ，使植物形成肿瘤。
此类物质主要在双子叶植物细胞壁 中合成，通常不存在于单子叶植物中 ， 农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物， 对大多数单子叶植物没有感染能力。
（1）农杆菌转化法
②原理：
质粒上的可以转移到受 体细胞，并整合到受体细胞 染色体的上。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵 早期胚胎培养
移植到子宫
新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：2法（ 2+增加细菌细胞的通透性）
常用菌：大肠杆菌
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接 纳外源的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采 用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移 质粒或重组分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进 行转化
电穿孔转化
微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：
2+处理大 肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态 细胞吸 收
细菌能够吸收的状态
受体生物 受体细胞
植物
受精卵 体细胞
动物
受精卵
导入方法
农杆菌转化法 基因枪法
花粉管通道法
显微注 射技术
微生物
细胞/个体
用2+处理成感 受态细胞
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自 身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
（2） 通过文库获得的目的基因没有启动子，只将编码 序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一 些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率 的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任 何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；
转化的原理与技术
2+诱导的完整细菌细胞的转化
2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性 细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其 原理是2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构， 后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙， 细菌细胞此时的状态叫做感受态
2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备：
100 菌体培养至600 = 0.5，离心收集菌体 用10 冰冷的20 2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 冰冷的100 2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：
取100 感受态细胞，加入相当于50 载体的重组 连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选