荧光原位杂交技术原理及操作步骤
单细胞荧光原位杂交技术基础分析
单细胞荧光原位杂交技术基础分析单细胞荧光原位杂交技术（single-cell fluorescent in situ hybridization，scFISH）是研究个体细胞基因组结构和功能的重要手段。
它通过特定的荧光标记探针与细胞内核酸靶点的结合来实现对单个细胞的基因表达模式分析。
本文将对单细胞荧光原位杂交技术的基本原理、方法以及在研究领域的应用进行详细介绍。
一、基本原理单细胞荧光原位杂交技术利用高度特异的核酸探针与细胞内特定的目标序列结合，通过荧光信号的检测来观察细胞的基因表达模式。
其原理主要包括以下步骤：1. 探针设计：根据所研究的基因或序列，设计特异性的DNA或RNA探针。
探针通常标记有荧光染料或荧光素，以便在显微镜下直接观察。
2. 细胞固定：将待研究的细胞进行固定，以保持其形态结构不变。
固定方法可以使用化学物质如乙醇或乙酸乙酯，或者采用热处理方法。
固定后，细胞的DNA或RNA会在某种程度上变性，使得探针能够更好地与其结合。
3. 探针杂交：将设计好的探针与固定的细胞一起进行孵育反应，使其在一定的温度和盐度条件下与目标序列发生特异性结合。
探针可以是产生互补序列的DNA或RNA，以便与目标序列形成特异性的双链结构。
4. 检测信号：利用荧光显微镜或其他适当的检测设备观察探针与目标序列的结合情况。
荧光标记的探针在特定波长下会发出荧光信号，通过检测信号的强度和位置，可以确定基因的表达量和位置。
二、方法步骤单细胞荧光原位杂交技术的实施通常包括以下几个步骤：1. 细胞样品处理：获取待研究的细胞样品，并进行适当的处理，如培养、分离、固定等。
处理过程中需注意细胞的完整性和特定的实验条件。
2. 探针设计和制备：根据研究目的选择合适的目标序列和探针设计方法。
针对目标基因或序列，用合成的核酸片段进行探针标记或直接购买商业化的标记好的探针。
3. 探针反应：将待研究的细胞样品与探针进行孵育反应。
反应条件应根据探针设计和实验需求进行优化，包括反应温度、时间和缓冲液的选择等。
荧光原位杂交技术的原理
荧光原位杂交技术的原理
荧光原位杂交技术（FISH）是一种用于检测细胞核内染色体异常、基因拷贝数变异和基因重排等的分子生物学技术。
其原理是利用荧光标记的探针与目标DNA特异性结合，通过显微镜观察荧光信号的分布和强度，进而对目标DNA序列的存在、数量和位置进行识别和分析。
FISH技术分为两类：利用探针单一荧光染色体、基因或DNA序列的单色法；以及同时使用多个探针标记不同染色体或基因序列的多色法。
单色FISH通常利用DNA探针或RNA探针，对目标序列进行特异性荧光标记，并通过观察其信号位置和数量来识别目标序列的存在和数量。
多色FISH则通过同时使用多个探针分别标记不同的目标序列，在显微镜下观察不同的荧光信号进行定位和分析。
FISH技术广泛应用于生物学和医学领域，包括染色体异常的诊断、肿瘤基因的检测、生殖医学和遗传学研究等。
随着技术的不断发展和完善，FISH技术已经成为细胞和分子生物学研究中不可或缺的重要技术手段之一。
- 1 -。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
荧光原位杂交
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一个很重要的生物学实验技术，它的特点是原位，无需经过PCR，可以用于对环境样品中特定的微生物进行定量分析。
下面是以活性污泥为例的FISH实验步骤及方法。
非生物学专业的同学请不要往下看了。
1 载玻片涂层处理（Slide coating）(1) 将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分钟(3) 放入60℃烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干2样品固定（Sample fixation）(1) 在样品（活性污泥）中加入3倍体积的4% 多聚甲醛（paraformaldehyde），置于4℃冰箱固定3小时以上或者过夜(2) 离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS(3) 离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的样品放入-20℃冰箱保存。
3 脱水（Dehydration）(1) 将适量固定后的样品放在载玻片上，(2) 放入46℃烘箱烘干10分钟(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟(4) 在空气中晾干4 杂交（Hybridization）(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法见下面表格）到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖(2) 在Hybridization buffer上加1微升探针（Probe）(3) 在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46℃恒温箱，杂交1.5小时(4) 将Washing buffer（配制方法见下面表格）预热到48℃，准备下一步使用5冲洗(1) 杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48℃Washing buffer(2) 在48℃恒温箱中放置30min(3) 用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干6镜检晾干后，将样品用适量的antifading reagent 覆盖，盖上盖玻片，然后就可以放到共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy）下观察了。
荧光原位杂交 FISH 实验操作步骤
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
荧光原位杂交技术原理及操作步骤
荧光原位杂交技术原理及操作步骤1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。
1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。
20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
1.原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素.地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性.定量或相对定位分析。
2.实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。
3.特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。
用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。
缺点是探针不稳定.自显影时间长.放射线的散射使得空间分辨率不高.及同位素操作较繁琐等。
采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。
FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1.荧光试剂和探针经济.安全；2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3.实验周期短.能迅速得到结果.特异性好.定位准确；4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
fish荧光原位杂交技术原理
fish荧光原位杂交技术原理
鱼荧光原位杂交技术（Fish）是一种用于研究和检测基因组中特定序列的分子生物学技术。
其原理可以帮助我们了解染色体的结构、性状以及异常变化，并在遗传学研究、肿瘤学、诊断和治疗方面起到重要作用。
Fish技术基于DNA的互补配对原理。
首先，确定需要检测的特定DNA序列，然后通过特殊的染色剂将该序列标记为荧光或放射性探针。
接下来，将标记的探针与待测DNA样品进行杂交，使其与样品中的靶标DNA序列互补配对。
在Fish技术中，采用的荧光或放射性标记通常与探针的序列完全互补，以确保精确的杂交。
标记的探针会与目标DNA 序列互相结合，形成稳定的杂交体。
然后，通过显微镜观察和图像分析，可以检测到杂交体的位置和强度。
Fish技术在染色体分析中具有广泛的应用。
例如，在细胞遗传学研究中，Fish可以用于确定染色体数目的异常、染色体变异和亚显型的检测。
在肿瘤学领域，Fish可以帮助识别染色体缺失、异常和重排，从而帮助进行肿瘤的诊断和治疗。
除了在基础研究和临床应用中的广泛运用，Fish技术还可
以用于其他领域。
例如，它可以用于检测食品中的基因改造成分、评估环境中的基因污染、研究动物和植物的进化等。
总结起来，鱼荧光原位杂交技术通过使用标记的探针与目
标DNA序列的互补配对，帮助我们了解染色体的结构和性状，检测基因组中的异常变化，为遗传学研究、肿瘤学诊断和治疗提供重要的工具。
它在各个领域都有着广泛的应用前景，将进一步推动生命科学的发展和进步。
荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术，其基本原理是依据碱基互补原理，应用荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化，进行定性和相对定量的分析检测。
FISH的实验流程主要包括以下步骤：
1. 探针标记：将荧光素直接或间接标记到探针DNA上。
2. 变性：将探针DNA和染色体或细胞核靶DNA分别变性成单链。
3. 杂交：将变性后的探针DNA与变性后的染色体或细胞核靶DNA按照碱基互补的原则进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸。
4. 观察记录：在荧光显微镜下观察并记录结果。
荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
荧光原位杂交技术
该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建 立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列 DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分 重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对 的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技 术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。
非放射性标记法
直接法
荧光素（fluorescein）或其他荧光染料
间接法
地高辛（digoxigenin） 生物素（biotin）
1. 随机引物法 2. 缺口平移法 3. PCR法 4. 寡核苷酸末端标记法 5. 直接在探针3’或5’端合成
1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul
5种荧光素联合标记人类24条染色体
荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
FITC ☆
☆☆ ☆
☆☆ ☆
☆☆☆ ☆
Cy3
△ △ △ △ △△
△
△
△△
Cy3.5
○
○○
○○ ○○
○○ ○ ○
Cy5
※※※※
※※
※※※※
4. 混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时
5. 65 ℃处理10min终止反应
染色体标本变性
共变性
杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中10分钟
荧光原位杂交(FISH)检测
目
CONTENCT
录
• 荧光原位杂交(fish)检测概述 • FISH检测的基本原理与技术流程 • FISH检测在临床诊断中的应用 • FISH检测的优势与局限性 • FISH检测的实际案例分析
01
荧光原位杂交(fish)检测概述
定义与特点
定义
荧光原位杂交（FISH）是一种基于荧光标记的DNA探针与目标DNA 结合，通过荧光显微镜观察并检测细胞内特定基因或染色体异常的 技术。
FISH技术可以应用于各种样本类型，如细胞、 组织切片、石蜡包埋组织等。
直接观察
FISH技术可以直接在细胞或组织的显微镜下观 察杂交信号，无需进行额外的染色或标记。
灵敏度高
FISH技术能够检测单个基因拷贝数的变化，灵 敏度较高。
局限性
成本高
FISH技术需要使用特殊的探针和 荧光染料，因此成本较高。
80%
基因突变
FISH技术可以检测基因突变，如 抑癌基因突变、致癌基因突变等 。
基因表达分析
基因表达水平
FISH技术可以检测基因表达水 平，了解基因在细胞中的表达 情况。
基因定位
FISH技术可以确定基因在染色 体上的位置，了解基因的染色 体定位。
基因互作
FISH技术可以检测基因间的相 互作用，了解基因间的关系。
细胞或组织的通透性处理
使用适当的试剂使细胞或组织的膜通透性增加，以便探针能 够进入。
杂交反应
探针与靶DNA的杂交
将制备好的探针与固定在样本上的靶 DNA进行杂交，形成探针-靶DNA复 合物。
去除未结合的探针
通过洗涤去除未结合的游离探针，提 高杂交信号的特异性。
信号检测与图像分析
原位荧光杂交操作规程(3篇)
第1篇一、目的原位荧光杂交技术是一种在细胞或组织切片上进行DNA或RNA定位的方法，通过对特定序列的DNA或RNA进行标记，从而实现对特定基因或染色体的定位和定量分析。
本规程旨在规范原位荧光杂交操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
二、适用范围本规程适用于所有原位荧光杂交实验，包括细胞原位杂交、组织切片原位杂交等。
三、材料与设备1. 材料：- 标本：细胞或组织切片- 探针：标记有荧光染料的DNA或RNA探针- 酶标抗体：针对探针标记的荧光染料- 洗涤液：如磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）- 抗荧光抗体：用于检测酶标抗体- 封片剂：如甘油封片剂2. 设备：- 荧光显微镜- 原位杂交仪- 热循环仪- 高速离心机- 显微镜载物台- 离心管- 移液器四、操作步骤1. 标本制备：- 将细胞或组织切片固定在载玻片上，进行脱水和透明处理。
- 将载玻片放入烘箱中，进行烘烤，使切片紧密贴合在载玻片上。
2. 探针制备：- 将探针进行变性，使其单链化。
- 将变性后的探针与标记有荧光染料的探针混合，进行杂交反应。
3. 杂交反应：- 将杂交混合物滴加在载玻片上的标本上，用封片剂封口。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行杂交反应。
4. 洗涤：- 将杂交后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
- 洗涤过程中，注意轻柔操作，避免破坏杂交结构。
5. 酶标抗体反应：- 将酶标抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行抗体结合反应。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行抗体结合反应。
6. 洗涤：- 将抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
7. 抗荧光抗体反应：- 将抗荧光抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行荧光抗体结合反应。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行荧光抗体结合反应。
8. 洗涤：- 将荧光抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
9. 封片：- 将封片剂滴加在载玻片上的杂交结构上，进行封片。
10. 观察与分析：- 将载玻片放入荧光显微镜中，进行观察和分析。
荧光原位杂交实验方法及步骤
荧光原位杂交实验⽅法及步骤2.38.1 实验⽅法及步骤(1) 探针变性将探针在75℃恒温⽔浴中温育5min，⽴即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。
(2) 标本变性a.将制备好的染⾊体玻⽚标本于50℃培养箱中烤⽚2～3h。
(经Giemsa染⾊的标本需预先在固定液中退⾊后再烤⽚)。
b.取出玻⽚标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
c.⽴即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰⼄醇系列脱⽔，每次5min，然后空⽓⼲燥。
(3) 杂交将已变性或预退⽕的DNA探针10µL 滴于已变性并脱⽔的玻⽚标本上，盖上18×18盖玻⽚，⽤Parafilm封⽚，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15～17h)。
由于杂交液较少，⽽且杂交温度较⾼，持续时间⼜长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进⾏。
(4) 洗脱此步骤有助于除去⾮特异性结合的探针，从⽽降低本底。
a.杂交次⽇，将标本从37℃温箱中取出，⽤⼑⽚轻轻将盖玻⽚揭掉。
b.将已杂交的玻⽚标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
c.在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
d.在室温下，将玻⽚标本于2×SSC中轻洗⼀下。
e.取出玻⽚，⾃然⼲燥。
f.取200µL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻⽚标本上，盖上盖玻⽚。
(5) 杂交信号的放⼤(适⽤于使⽤⽣物素标记的探针)a.在玻⽚的杂交部位加150µL封闭液I，⽤保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
b.去掉保鲜膜，再加150µL avidin-FITC于标本上，⽤保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。
c.取出标本，将其放⼊已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
荧光原位杂交FISH技术---经典全面
FITC/594 Avdin TSA-Biotin 放大系统
过氧化物酶（POD）/ 磷酸酶（AP）
连接臂
地高辛标记探针
探针制备流程
RNA抽提
反转cDNA
质粒合成
带有T7、SP6序列及 目的基因的质粒
扩增目的基因
设计带有T7/SP6/T3 序列的引物
线性化 体外转录 地高辛标记探针合成反应
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成
技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH
基因组原位杂交（GISH）
RNA-FISH
T-FISH
蚕豆
红小豆
黄豆
豇豆
绿豆
水 稻
小 麦
玉 米
欢迎大家批评指正!!
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
一、技术原理 二、操作步骤 三、技术应用 四、技术进展
技术原理
原位杂交技术in situ hybridization(ISH)：通过 已知的碱基序列并带有标记物的探针与组织、细胞 中待测的mRNA进行特异性结合，形成杂交体，然 后再运用与标记物相应的检测系统，在核酸的原有 位置对其进行定位的方法。
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。
其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。
试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。
称量试剂勺也要干烤。
塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。
若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：（a）缓冲溶液1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
荧光原位杂交实验具体步骤及方法
荧光原位杂交实验具体步骤及方法用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。
1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。
20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。
1．原理
FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
2．实验流程
FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。
3．特点
原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。
用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。
缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。
采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。
FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。
4．应用
该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。
在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。
荧光原位杂交FISH操作规程
一、主要试剂
1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml
2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程
1 硅化玻片切片烤片60过夜
2 脱蜡入水斜置切片空干
3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35
4 0.2M HCl处理室温10接步骤3
5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3
6 切片入20梯度酒精脱水各2空干
7 切片入85变性液8
8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干
9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜
10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
11 2SSC洗涤405min2SSC洗涤375min
12 PBD洗涤切片32
13 滴加异硫氢酸荧光素标记的亲和素AvidinFITC,塑膜封片3730min
14 洗涤同步骤12
15 滴加抗亲和素AntiAvidin, 3730min
16) 重复步骤121312
17 滴加DAP/I(二脒基二苯基吲哚/碘化丙啶)直接封片荧光镜检上。