微卫星不稳定性大肠癌
大肠癌微卫星不稳定性及其临床意义
大肠癌微卫星不稳定性及其临床意义关键词：结直肠肿瘤；微卫星DNA；微卫星不稳定性【摘要】目的了解大肠癌微卫星不稳定性（microsatellite instability, MI）情况。
方法用6个微卫星位点检测PCR扩增所选位点PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染。
结果60例大肠癌中，20例表现MI，其中11例为复制错误（replication errors, RER）阳性。
RER阳性与RER阴性大肠癌患者相比，发病年龄较年轻，一级亲属有恶性肿瘤病史者明显高于RER阴性，倾向位于结肠，呈浸润性生长，Ⅲ～Ⅳ期比例高。
5例大肠癌伴大肠腺瘤病例中，4例腺瘤有MI。
结论中国人大肠癌MI发生率介于文献报道之间，MI为大肠癌形成过程中的早期分子事件，RER为肿瘤易感指标之一。
微卫星DNA 是大量随机分布于真核生物整个基因组中的1～6个简单重复核苷酸序列，微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)是指由于复制错误(replication errors, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失，其在恶性肿瘤发生发展过程中的作用已受重视，被认为是大肠癌的一种发病机制。
我们对60例大肠癌组织的MI进行了研究，并结合临床病理资料，探讨其临床意义。
材料与方法1.标本收集和基因组DNA提取：自浙江医科大学第二附属医院肿瘤科1996年3月～1997年5月间经病理证实的大肠癌患者60例，男37例，女23例。
年龄32～78岁，平均年龄(56±12)岁。
按Dukes分期标准，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例。
现场取手术切除组织标本，立即置入液氮中保存，直至提取基因组DNA。
每份标本包括肿瘤组织和相应的正常肠粘膜，基因组DNA提取采用蛋白酶k消化，酚氯仿抽提法。
2.MI检测：选用了D2S119、D13S160、D8S282、D3S1293、D2S123和D18S58等6个微卫星位点进行检测，PCR反应体系为50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-Cl, 0.1%Trito X-100, 1.5 mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTPS,模板DNA200 ng，上下游引物各50 pmol，Taq酶1U，加去离子水至50 μl。
微卫星不稳定与大肠癌相关性的研究进展
关 以来 ， 来越 多 的实验 研究 证实 错 配修 复基 因 越
的失活 在大 肠癌 的发 生 及 预后 中起 着 重 要 的作 用 。
配 的安全 保 障系统 ， 由一 系列 能特异 性识 别 、 向 它 双 切 除并修 复错 配碱 基 的酶 分 子 组成 ， 保持 遗 传 物 对
质 的稳定 性 和完整 性 、 免遗 传 突 变 的 产 生具 有 重 避 要 作 用 。 ＭＭＲ 系 统 主 要 包 含 以 下 几 种 蛋 白 ： ＭＬＨ１ ＭＳ 、 Ｈ３ ＭＳ 、 Ｈ２ ＭＳ 、 Ｈ６和 Ｐ ２ 它 们 之 问 ＭＳ ， 相 互 连接 形成 异 源二 聚体 。ＭＳ Ｈ２分 别 与 ＭＳ 、 Ｈ６
２ ＭＳ Ｉ与 大 肠 癌
ｒ ｓｔｌｔ ｓａ ｉｔ ， Ｉ最 常 见 的错 误 是 碱 基 错 ｏ ａｅ ｉ ｉ ｔｂｌ ｙ ＭＳ ） ｌｅ ｎ ｉ 误 配对 ， 脱 了 Ｄ 逃 ＮＡ 聚 合 酶 、 入一 失 回路 的 本 插 缺 身 固有 的校 对 功 能 。肿 瘤 的 ＭＳ 是 指 与 正 常 细 胞 Ｉ 相 比， 瘤 细胞 中 某 一 微 卫 星 长 度 发 生 改 变 ， 称 肿 也
Ｄ ＮＡ 双 链 有 效 正 确 配 对 起 来 。 微 卫 星 不 稳 定 （ ｃ ｍｉ —
错 配 ， 能 与有 关 的酶 配合 ， 除含 有 错配 的 Ｄ 就 切 ＮＡ 片段 ， 合 成新 的 Ｄ 并 ＮＡ 片 段 以代 替 被切 除 的 部分 ， 进 而完 成错 配 Ｄ ＮＡ 链 的修 复 过 程 。ＭＭＲ 缺 失 会 导致 Ｄ ＮＡ 链 错配 的积 聚 ， 而 导致 ＭＳ 。 从 Ｉ
可识 别 单 个 碱 基 错 配 ， ｔ￣可 识 别 ２ ４个 碱 ＭｕＳ ～ 基 甚 至更 多 的 插 入 或 缺 失 错 配 ｌ 。ＭＬ ３ ］ Ｈ１则 分 别
深度解析：关于MSI（微卫星不稳定性）
深度解析：关于MSI（微卫星不稳定性）图1 MSI在肿瘤细胞中序列长度发⽣改变根据造成结直肠癌MSI分⼦机制的不同可分为两类：）：常由MLH1启动⼦区域⾼DNA甲基化造成MMR功1. 偶发性MSI结直肠癌（sporadicCRC）：能缺陷引起MSI。
偶发性MSI结直肠癌约占所有结肠癌患者的12%，易发⽣在⽆明显家族遗传史的⽼龄化个体中，MMR缺陷直接发⽣在结直肠癌体细胞中；）：⼜称Lynch综合症，占所有结直肠癌患者的2%-2. 遗传⾮息⾁病性结直肠癌（HNPCC）：5%，家族遗传性疾病，由于⽣殖细胞中携带有MMR基因突变，因⽽MMR功能易缺陷导致MSI结直肠癌出现。
常见Lynch综合症患者中MMR基因突变位点易发⽣在四个相关基因中：MLH1，MSH2，MSH6，PMS2。
根据结直肠癌中MSI被检测出的频率可以将其分为三类（图2）：MSS，⽆明显的MSI出现；MSI-L，MSI出现频率低，⼀般低于30%；MSI-H，MSI出现频率低，⼀般⾼于30%。
图2 美国NCI机构制定的MSI检测分类标准⼀、MSI常⽤检测⽅法：MSI常由MMR基因突变及功能缺失导致。
因此，在检测癌细胞中MSI时，既可以直接检测MSI序列变化，也可以通过检测MMR基因缺失来确定是否发⽣MSI。
两种检测⼀致性很好，MSI检测发现的结直肠癌中近93%也适⽤于MMR基因缺陷检测。
不同的是技术⼿段，MMR基因缺陷检测常依赖于免疫组化（蛋⽩⽔平），⽽MSI检测⼀般依赖于分⼦⼿段，PCR检测(DNA⽔平)（图3）。
图3 MMR免疫组化检测与MSI分⼦检测结果免疫组化检测的优势是可以直接鉴定出导致MSI发⽣的MMR缺陷基因，但是，约5%-11%的MSI发⽣并不会出现MMR蛋⽩的缺陷。
某些MMR蛋⽩错义突变，会损失MMR功能，但能被抗体检测识别，因此这是分⼦检测的优势，⽬前常⽤的检测MSI的⽅法是分⼦检测结合免疫组化检测。
⼆、MSI检测——NCCN指南解读1、MSI检测应在所有结直肠癌史的病⼈中进⾏针对结直肠癌患者的MSI检测准确度⾼图4 MSI分⼦检测结直肠癌常⽤marker⽬前，近15%的偶发结直肠癌及Lynch综合症结直肠癌患者含有MSI特征，通过MSI分⼦检测可以精准的检测结直肠癌中的MSI，尤以对MSI-H患者的检测，近100%准确度。
微卫星不稳定与结直肠癌的关系_管蕾
结直肠癌微卫星不稳定性作用的进展
结直肠癌微卫星不稳定性作用的进展微卫星不稳定性：定义MMR对校正DNA复制过程中发生的错误配对非常重要，该修复系统主要包括4个蛋白，MLH、MSH2、MSH6和PMS2。
微卫星是包含1-6个碱基的重复DNA序列，分布于整个基因组，微卫星对复制错误易感，正常时可由MMR系统修复，缺失一个MMR蛋白功能时导致MMR系统缺陷，致微卫星复制错误累积，造成遗传不稳定性。
MSI发生在关键细胞功能与途径的编码区时具有致癌潜能，可以通过PCR扩增特异的微卫星标志或是免疫组化检测MMR蛋白缺失来发现MSI。
LS时MSI通常与一个MMR基因胚系突变有关（多为MLH1或MSH2），而散发MSI CRCs 通常是由hMLH1启动子甲基化表观失活所致。
林奇综合征LS是最常见的遗传性CRC，是高度不完全外显性常染色体疾病，特征是早期发作的结直肠癌和子宫内膜癌，某些结肠外癌症发生风险增加，包括其它部位的胃肠道肿瘤、泌尿道系统肿瘤以及女性生殖系统肿瘤，女性发生CRC风险52.2%，男性68.7%，中位诊断年龄61.2岁。
Amsterdam和Bethesda标准用于鉴别可能为L S的患者以进一步行遗传学检查，如表1和2所示。
现在许多指南建议采用二种方法排除LS：一种普遍适用，每个CRC患者均进行检测，另一种是＜70岁诊断CRC患者进行检测以及≥70岁、但满足Bethesda标准患者进行检测，超过1/4的LS患者漏诊（图1）。
表1 修订后Bethesda关于LS相关CRC 指南表2 Amsterdam II标准图1 林奇综合征诊断流程免疫组化与遗传学检查结果的吻合性很好，新专家共识推荐使用一组5个单核苷酸重复序列（BAT-25、BAT-26、NR21、NR24和NR27），其特征是不同个体间的单核苷酸重复序列数量和大小恒定。
根据MSI多少，CRCs分成高度微卫星不稳定性（MSI-H）、低度微卫星不稳定性（MSI-L）。
MSI-H 表型是5个标志中至少有2个不稳定标志，而多数散发CRCs 为微卫星稳定性（MSS），缺少MSI特征。
（综述）结直肠癌中的微卫星不稳定性
（综述）结直肠癌中的微卫星不稳定性结直肠癌至今依然是西方国家最主要的公共卫生问题，在男性和女性常见癌症中均排在前三位。
结直肠癌的5年总生存率接近65%，根据疾病的等级略有差别（Ⅰ期生存率达90%，而Ⅳ期生存率仅为15%）。
随着新筛查手段的出现，2015年有超过70%的新发患者实施预防性的切除手术。
尽管传统的临床病理分期仍用于结果的预测，但病理结果表现为同期的结直肠癌，在预后和治疗应答上有显著的异质性。
这种临床异质性至少有部分是与结直肠癌发病过程中的遗传变异有关：85%的结直肠癌是由染色体改变驱动（染色体不稳定性通路），15%是由DNA 错配修复系统（MMR）功能缺失驱动（微卫星不稳定性（MSI）通路）。
MSI是遗传性非息肉型结直肠癌（也称林奇综合征）的分子标记，通常与MMR基因的胚系突变相关。
然而，绝大部分MSI的案例都是散发的结直肠癌，更常见的是由hMLH1的表观遗传失活导致。
不同级别的结直肠癌表现出MSI的比例也是不同的：Ⅱ、Ⅲ期中有15%（更常见于Ⅱ期），Ⅳ期中有4%-5%。
该综述总结了具有MSI的结直肠癌的临床病理特征，MSI状态在早期和转移性结直肠癌中的预后和预测意义，以及对新药研发的影响。
微卫星不稳定性的定义错配修复系统对DNA复制过程中DNA序列错配的校正至关重要。
这种修复系统主要由四个蛋白（MLH1, MSH2, MSH6 和PMS2）构成，它们相互配合检测并切断错配，使DNA聚合酶和DNA连接酶能够重新合成并重新连接正确的DNA链。
微卫星是遍布于人类基因组中（编码区和非编码区）的1-6个碱基的短串联重复序列，由于它们的重复结构，微卫星特别容易发生由MMR系统负责修复的复制错误。
MMR任一蛋白的功能丧失都会引起MMR系统缺陷，进而导致微卫星错误的累积，例如插入或缺失导致遗传不稳定性。
当MSI发生在关键的细胞功能区或关键通路上基因的编码区时，其可能具有致癌潜能。
林奇综合征患者的MSI与MMR基因的胚系突变有关（通常表现在MLH1或MSH2），而散发的结直肠癌患者的MSI通常与hMLH1基因启动子甲基化导致的表观遗传失活有关。
微卫星高度不稳定大肠癌临床病理分析及免疫组化异质性探讨
微卫星高度不稳定大肠癌临床病理分析及免疫组化异质性探讨发布时间：2023-06-02T11:28:52.070Z 来源：《医师在线》2023年1月2期作者：刘智慧1 田杰2 [导读]微卫星高度不稳定大肠癌临床病理分析及免疫组化异质性探讨刘智慧1 田杰2（1.齐齐哈尔市中医医院；2.黑龙江迪安医学检验所有限公司；黑龙江哈尔滨150080）【摘要】目的：探析微卫星高度不稳定（MSI-H）大肠癌临床病理特征以及免疫组化异质性表达特征，以期提高临床对MSI-H大肠癌的认知。
方法：收集2019年6月-2020年6月期间我院收治的已知微卫星稳定性表型大肠癌患者33例并对其资料进行回顾性分析，对其组织形态以及免疫组化表型（包括MLH1、MSH2、MSH6以及PMS2）进行分析总结，估算肿瘤细胞阳性率，并对基因检测结果进行分析。
结果：大肠癌病灶显微镜下观察可见原有正常的肠黏膜被异型腺体/异型细胞巢所取代，病理改变主要表现为黏液分化或是髓样分化以及克罗恩样淋巴细胞浸润。
免疫组化结果：微卫星稳定（MSS）大肠癌患者错配修复蛋白核染色均为阳性且无缺失；MSI-H大肠癌患者上述4种错配修复蛋白中至少有一种蛋白染色核的一致性有缺失现象，病例2和病例5的MSH6以及病例8的MSH6以及MSH2还伴有异质性缺失的情况。
其肿瘤细胞阳性率分别为70%、20%和80%，所对应的基因检测结果依次为未突变、突变和未突变；Ki67指数为30-90%。
结论：MSI-H大肠癌的临床表现、形态学以及免疫组化特征均与MSS大肠癌有所差异，MSI-H大肠癌存在免疫组化异质性缺失的现象，但本次研究病例较少，其阳性率截断值仍有待于进一步扩大样本后进行探讨。
【关键词】微卫星高度不稳定；大肠癌；病理；免疫组化异质性微卫星不稳定（MSI-H）是大肠癌发生发展的分子途径之一[1]，此类型患者的预后明显优于微卫星稳定（MSS）大肠癌患者，因此在大肠癌患者中识别MSI对制定术后化疗方案、预后分期等方面均有非常重要的意义。
微卫星不稳定性（MSI）在结直肠癌诊断及预后中的应用
微卫星不稳定性（MSI）在结直肠癌诊断及预后中的应⽤1 微卫星（microsatellites）不稳定性微卫星（microsatellites）⼜称简单重复序列，是存在于基因组中的⼀些⼩⽚段核苷酸的重复序列，重复单位⼀般由1~6个核苷酸组成，重复次数不超过60次，具有⾼突变性。
DNA 在复制过程中，尤其是微卫星，可能会出现碱基错配等错误，这些错误累积起来并⼀代代的传递下去，最终会产⽣基因突变进⽽导致细胞癌变。
这种在DNA复制过程中产⽣的⼀些简单重复序列的插⼊或缺失，被称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）[1]。
2 MSI与错配修复（MMR）蛋⽩间的关系DNA错配修复（Mismath repair, MMR）系统由⼀系列特异性修复DNA碱基错配的酶分⼦(MMR蛋⽩）组成。
MMR蛋⽩的主要功能是修复DNA复制过程中产⽣的错配，包括单碱基错配和2个以上的插⼊/缺失错配，从⽽保持遗传物质的完整性和稳定性，避免遗传物质发⽣突变。
据⽬前报道：涉及⼈类DNA错配修复的MMR蛋⽩主要有5个，其编码基因分别为MLH1、 PMS1 、PMS2、MSH2和 MSH6。
MMR系统会对在DNA复制过程中的碱基错配等错误进⾏纠正，⼀旦修复系统失效，基因突变的风险便会提⾼。
因此，MMR基因突变后， DNA复制时的过程中便会发⽣MSI[2, 3]。
3 MSI判定标准MSI的检测⽅法很多。
⽬前较常使⽤的检测技术为聚合酶链反应（PCR）和免疫组化（IHC）检测[4]。
PCR检测，⽬前公认的标志物套餐由BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR22或NR27组成。
当检测的微卫星标志物中没有发现异常，标本定义为微卫星稳定性（MSS）；如果有⼀个标志物或低于40%的标志物显⽰异常，则标本被认定为低⽔平微卫星不稳定性(MSI-L)；当测试标志物的40%或超过40%异常时，标本被认定为⾼⽔平微卫星不稳定性（MSI-H）。
微卫星不稳定性大肠癌
HPNCC临床特征
• 发病年龄小 • 多位于脾曲近侧 • 预后良好 • 同时患有胃癌，子宫内膜癌，小肠癌，输
卵管或肾盂癌，卵巢癌等其他癌症
Amsterdam标准
• 3 位或更多位亲属患CRC，其中一位是其 他两位的一级亲属
• 至少连续两代患有CRC
• 一例或更多例发病早于50岁
Amsterdam标准Ⅱ
中国标准
• 家系中至少有2例组织病理学明确的大肠癌 患者；其中至少2例为一级亲属关系，并符 合以下1条
– 1．至少1例为多发性大肠癌患者（包括腺瘤） – 2．至少1例发病早于50岁 – 3．家系中至少1人患有HPNCC肠外恶性肿瘤
（包括胃癌，子宫内膜癌，小肠癌，输卵管或 肾盂癌，卵巢癌，肝胆系统癌）
MSI大肠癌的预后
• MSI-H结直肠癌患者预后较好
MSI大肠癌的化疗
• MSI-H大肠癌对化疗药 物如顺铂、卡铂和5FU较为耐受，化疗获 益不多，而IFL的效果 也有待考证。
58 vs 33%, p=0.043 37 vs 32%, p=0.816 90 vs 35%, p=0.0007
HPNCC
什么是微卫星
D2S123 TAGGCCACACACACACACACA
• 单个、两个、三个或四个核苷酸重复序列，如(A)n、 (CA)n等，重复次数大多为10~50次，长度多数短于200碱 基对，其中大部分位于非编码序列，但也可以位于TGF、 BAX等编码基因的外显子。
微卫星位点
• BAT-25 • BAT-26 • D5S346 • D2S123 • D17S250
• 行结肠或直肠癌相应区域切除，术后能定期肠镜检查
HPNCC预防
• 从25岁开始,每2年肠镜检查1次,35岁后改为每年1 次,直至70岁,以及时发现大肠腺瘤,予以摘除,以 预防大肠癌的发生;对女性携带者,从30岁起应每 年1次妇科检查。