第八章比色法及分光光度法测试
比色法和分光光度计分析法
分光光度计分析法的原理
分光光度计分析法的原理基于朗伯-比尔定律，即当一束单 色光通过溶液时，光线被吸收的程度与溶液的浓度和液层 的厚度成正比。
通过测量特定波长的光线通过溶液后的透射强度，可以计 算出溶液中目标物质的浓度。分光光度计可以自动调整波 长，并使用光电检测器测量透射光线强度，从而得到吸光 度值。
比色法对实验条件要求不高，可 在普通实验室进行。分光光度计 分析法需要使用精密仪器，对实
验室环境有一定要求。
实验时间
比色法操作简便，实验时间较短 。分光光度计分析法需要较长时
间进行波长调整和测量。
准确度的比较
准确度
分光光度计分析法具有较高的准确度 ，能够更准确地测量待测物质的浓度 。比色法准确度相对较低，但适用于 一般实验室和现场检测。
挑战与机遇
挑战
尽管比色法和分光光度计分析法具有许多优点，但仍存在一些挑战，如样品预处理、干扰物质的影响以及仪器设 备的普及程度等。
机遇
随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，比色法和分光光度计分析法将面临更多的发展机遇。同时，政府支 持、市场需求和技术创新也将为其发展提供有力支持。
谢谢您的聆听
THANKS
05
未来展望
技术发展展望
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的进步，比色法和分光光度计分
析法将更加智能化，实现自动化、快速和准确的检测。
高灵敏度
02
提高检测灵敏度是未来的重要发展方向，以便更好地检测低浓
度的物质。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，能够同时测定多种目标物质，提高
分析效率。
应用领域展望
干扰因素
重复性
分光光度计分析法的重复性较好，结 果稳定。比色法重复性相对较差，受 操作影响较大。
《药物分析学》第八章复习检测题及答案
《药物分析学》第八章杂环类药物的分析复习检测题一、选择题1．用于吡啶类药物鉴别的开环反应有：（）A、茚三酮反应B、戊烯二醛反应C、坂口反应D、硫色素反应E、二硝基氯苯反应2．下列药物中，哪一个药物加氨制硝酸银能产生银镜反应（）A、地西泮B、阿司匹林C、异烟肼D、苯佐卡因E、苯巴比妥3．硫酸－荧光反应为地西泮的特征鉴别反应之一。
地西泮加硫酸溶解后，在紫外光下显：（）A、红色荧光B、橙色荧光C、黄绿色荧光D、淡蓝色荧光E、紫色荧光4．下列药物中，哪一个药物加氨制硝酸银能产生银镜反应（）A、地西泮B、阿司匹林C、莘巴比妥D、苯佐卡因E、以上均不对5．有氧化剂存在时，吩噻嗪类药物的鉴别或含量测定方法为（）A、非水溶液滴定法B、紫外分光光度法C、荧光分光光度法D、钯离子比色法E、pH指示剂吸收度比值法6．异烟肼不具有的性质和反应是（）A、还原性B、与芳醛缩合呈色反应C、弱碱性D、重氮化偶合反应7．苯骈噻嗪类药物易被氧化，这是因为（）A、低价态的硫元素B、环上N原子C、侧链脂肪胺D、侧链上的卤素原子8．地西泮中有关物质的检查，检查方法为：取本品，加丙酮制成每1ml合100ml溶液作为供试液；精密量取供试溶液适量。
加丙酮制成1ml中含0.3mg的溶液，作为对照液。
吸取上述两溶液各5ml，分别点于同一硅胶板上，进行检查，其杂质限量为（）A、0.03%B、0.02%C、3%D、0.3%E、0.1%9．可与AgNO3生成银镜反应的药物有（）A、氯丙嗪B、安定C、尼可刹米D、阿司匹林E、以上都不对10．用差示分光光度法检查异烟肼中的游离肼，在叁比溶液中需加入（）A、醋酸B、氯仿C、甲醇D、乙醇E、3%丙酮11．异烟肼中的特殊杂质是（）A、游离肼B、硫酸肼C、水杨醛D、对一二甲氨基苯甲醛E、SA12．苯并二氮杂卓类药物中有关物质和降解产物的检查，中国药典主要采用（）A、TLC法B、GC法C、IR法D、UV法E、差示分光光度法13．可与AgNO3作用生成银镜反应的药物有（）A 、氯丙嗪 B、安定 C、异烟肼 D、尼可刹米 E、阿司匹林14．中国药典采用戊烯二醛反应鉴别尼可刹米，形成戊烯二醛反应的试剂为（）A、溴化氰B、溴化钾C、碘化钾D、溴酸钾E、氯化钾15．采用戊烯二醛反应可以鉴别的药物是（）A、巴比妥B、对乙酰氨基酚C、乙酰水杨酸D、异烟肼E、利眠宁16．尼可刹米是属于哪类药物（）A、芳酸类B、杂环类C、维生素类D、抗生素类E、芳胺类17．钯离子比色法是以下药物中哪个药物的定量分析法（）A、盐酸氯丙嗪B、异烟肼C、尼可刹米D、乙酰水杨酸E、利眠宁18．用溴酸钾法测定异烟肼的依据是（）A、吡啶环的弱碱性B、酰肼基的还原性C、吡啶环的特性D、遇碱水解后，释放出的二乙胺的特性E、以上均不对19．中国药典对异烟肼原料和注射用异烟肼中，游离肼的检查均采用（）A、差示分光光度法B、比浊法C、薄层色普法D、HPLC法E、GC20．某些吩噻嗪类药物在非水介质中滴定时易产生红色的氯化产物而干扰结晶紫指示终点的变化，除去干扰可加入（）A、NaHSO3B、Na2SO3C、VB1D、VC（抗坏血酸）E、硫代硫酸钠21．用铈量法测定吩噻嗪类药物，指示终点的方法为（）A、加酚酞指示终点B、加甲基橙C、加溴酚蓝D、加甲基红E、自身指示剂22．对于吩噻嗪类药物，可排除氧化产物干扰的鉴别和含量测定方法是（）A、与Fe3+呈色B、铈量法C、非水滴定法D、薄层色普法E、以上都不对23．在强酸性介质中的溴酚钾反应是测定（）A、对乙酰氨基酚的含量B、巴比妥类的含量C、维生素C的含量D、止血敏的含量E、以上都不对24．异烟肼中的特殊杂质是指（）A、硫酸肼B、水杨醛C、SAD、对一二甲氨基苯甲醛E、以上都不对25．某些吩噻嗪类药物在非水介质中滴定时易产生红色的氯化产物而干扰结晶紫指示终点的变化，除去干扰可加入（）A、NaHSO3B、Na2SO3C、VB1D、Na2S2O3E、以上都不对26．对于吩噻嗪类药物可排除氧化产物干扰的鉴别和含量测定方法是（）A、与金属离子络合呈色（钯离子比色法）B、与Fe3+呈色C 、非水滴定法 D、铈量法 E、薄层色谱法27．用差示分光光度法检查异烟肼中游离肼，在叁比溶液中加入（）A、甲醇B、乙醇C、醋酸D、氯仿E、丙酮（3%）28．异烟肼的含量测定，2005版药典采用溴酸钾法，所用的指示剂为（）A、乙氧基黄啥精B、甲基红C、酚酞D、甲基橙E、结晶紫29．酰肼基团的反应是以下哪个药物的鉴别反应（）A、巴比妥类B、维生素B1C、异烟肼D、尼可刹米E、青霉素30．在强酸介质中的KBrO3反应是测定（）A、异烟肼含量B、对乙酰氨基酚含量C、巴比妥类含量D、止血敏含量E、维生素C含量31．异烟肼与芳醛发生缩合反应其产物是（）A、形成配位化合物B、放出二乙胺气体C、形成沉淀D、形成腙E、形成银镜反应32．酰肼基团是下列哪个药物的用于鉴别，定量分析的基团（）A、青霉素类B、尼可刹米类C、巴比妥类D、盐酸氯丙嗪E、以上都不对33．根据吩噻嗪类药物的结构特点，对其进行定量分析时不宜采用方法是（）A、非水溶液滴定法B、在胶束水溶液中滴定C、紫外分光光度法D、铈量法E、钯离子比色法34．根据异烟肼的结构特点，对其进行定量分析时不宜采用方法是（）A、溴酸钾法B、溴量法C、剩余碘量法D、钯离子比色法E、非水溶液滴定法35．根据利眠宁的结构特点，对其进行定量分析时不宜采用方法是（）A、非水溶液滴定法B、紫外分光光度法C、比色法D、高效液相色谱法E、铈量法36．下列方法中可用于异烟肼含量测定的是（）A、非水酸量法B、碘量法 D、溴酸钾法 E、亚硝酸钠法二、填空题1．铈量法测定氯丙嗪含量时，当氯丙嗪失去个电子显红色，失去个电子红色消褪。
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
分子光谱法
2、
跃迁
处于成键轨道上的 电子跃迁到 反键轨道上，称
为
跃迁。
跃迁吸收峰的波长在20nm附近，其特征是吸 收强度大（ ＞104）。
不饱和有机物，如具有
或
、
等基
团的有机化合物都会产生
跃迁。
第八章 分子光谱法
3、
跃迁
含有杂原子的不饱和基团，如C=O、C=S、N=N等化
合物，其未成键轨道中的n电子吸收能量后，向 反
第八章 分子光谱法
三、分子吸收光谱的基本原理 由光吸收定律及光与物质的相互作用可知，任何一种 物质对不同波长的光的吸收程度都是不相同的。
以溶液为例，将各种不同波长的单色光依次通过一定 浓度和液层厚度的某有色溶液，测量每一波长下该有 色溶液对光的吸收程度（即吸光度），然后以波长为 横坐标，以吸光度为纵坐标作图，即可得一曲线。该 曲线称为吸收曲线或吸收光谱。
分子光谱法分为吸收光谱法（如红外吸收光谱法、紫 外及可见吸收光谱法等）、发射光谱法（如荧光光谱 法）及散射光谱法（如拉曼光谱）三种基本类型。
在一般情况下，分子处于基态，当光与物质发生相互作用时，分子 吸收光能，从低能级跃迁到高能级产生吸收光谱。若分子从高能级 回复到低能级则释放出光能，形成发射光谱。散射光谱是光被物质 散射时，分子内能级的跃迁改变散射光频率而产生的。
第八章 分子光谱法
二、分子吸收光谱中的跃迁类型 化合物分子中主要还有三种类型的价电子，即形成单 键的 电子、形成双键或三键的 电子及未成键的n电子 （也称为p电子）。根据分子轨道理论，分子中这三 种电子的成键和反键分子轨道能级高低顺序为：
分子中不同轨道的价电子具有不同的能量，处于较低能级 的价电子吸收一定能量后，可跃迁到较高能级。在紫外可见光区，吸收光谱主要由 跃迁产生。
【分析】第八篇吸光光度法
【关键字】分析第八章吸光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。
包括比色法、看来及紫外分光光度法等。
本章主要讨论看来光区的吸光光度法。
利用看来光进行分光光度法分析时，通常将被测组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。
例如：测量钢样中Mn的含量，在酸性溶液中将Mn 氧化为MnO4-，然后进行吸光度的测量。
与化学分析法比较它具有如下特点：（一）灵敏度高分光光度法常用于测定试样中1－0.001%的微量组分。
对固体试样一般可测至10-4%。
（二）分析微量组分的准确度高例如：含铁量为0.001%的试样，如果用滴定法测定，称量试样，仅含铁0.01mg，无法用滴定分析法测定。
如果用显色剂1，10-邻二氮杂菲与铁生成橙红色的1，10-邻二氮杂菲亚铁配合物就可用吸光光度法来测定。
Fe2+ + 3(1,10-phen) → [ Fe(1,10-phen)3] 2+（三）操作简便，测定快速（四）应用广泛几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用分光光度法测定。
可用来研究化学反应的机理、溶液中配合物的组成、测定一些酸碱的离解常数等。
§8-1 吸光光度法基本原理一、物质对光的选择吸收当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生了反射、散射、吸收或透射（p241, 图9-1）。
若被照射的是均匀的溶液，则光在溶液中的散射损失可以忽略。
当一束由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光复合而成的白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。
当透射光波长在400-700nm范围时，人眼可觉察到颜色的存在，这部分光被称为看来光。
透射光和吸收光呈互补色，即物质呈现的颜色是与其吸收光呈互补色的透射光的颜色。
例如：CuSO4溶液由于吸收了580-600 nm的黄色光，呈现的是与黄色呈互补色的蓝色。
不同波长的光具有不同的颜色，见P294,表9-1。
物质吸收了光子的能量由基态跃迁到较高能态（激发态），这个过程叫做物质对光的吸收。
第八章分光光度法
②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状
相似λmax不变。而对于不同物质，它们的 吸收曲线形状和λmax则不同。
2021/2/10
③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作 为物质定性分析的依据之一。
④在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，
所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中 选择入射光波长的重要依据。
T = It I0
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kLc
T10 k L c10 A
2021/2/10
吸光度A、透射比T与浓度c的关系
A
T
T =10-kbc
A=kLc
c
2021/2/10
K 吸光系数 Absorptivity
当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，
2021/2/10
吸光度与光程的关系 A = Lc
吸光度
0.00
检测器
吸光度
0.22
L
检测器
吸光度
0.44
样品
L
L
检测器
2021/2/10
样品 样品
光源 光源 光源
吸光度与浓度的关系 A = Lc
吸光度
0.00
L2>L1
光源
检测器 吸光度
0.22
L1
检测器
吸光度 L2
0.42
光源 光源
检测器
2021/2/10
量。
解：
C(mo/l
L)
A
b
0.57 2.51033
7.6105
摩尔质量为：
m 10000.001%0
M(g/mo)l n
7.6105
第8章 分光光度法
24
3、吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池
紫外区：
石英池
4、检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管 5、显示系统： 低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录
25
单色器
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同
800
λ1
白光
19
（二）化学因素
• Beer定律适用的另一个前提：稀溶液 • 浓度过高会使C与A关系偏离定律
20
8.2 比色法和分光光度法
8.2.1 比色法 1.目视比色法
观察方向
cc 12
c1
c2
c3
c3
c4
c4
方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。
21
2. 光电比色法
通过滤光片得一窄范围的所谓单色光(几十nm)
4
光学光谱区
远紫外
（真空紫外）
近紫外 可见
近红外
中红外
远红外
10nm~200nm 200nm ~380nm
380nm 780 nm ~ 780nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
5
溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm
400-450 450-480 480-490
2) 磷的测定: DNA中含P～9.2%, RNA中含P～9.5%, 可得核酸量.
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 =(NH4)3PO4· 12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄(小) Sn2+
比色法和分光光度法及其仪器
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分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
2
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目录
CONTENTS
1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
《分光光度测定方法》课件
化学工业
分光光度测定方法被广泛 应用于化学工业中的质量 控制、研发和品质检测。
环境科学
分光光度测定方法可以用 于水质、大气和土壤等环 境样品的分析和监测。
总结和展望
分光光度测定方法是一种强大而广泛应用的分析技术，对于解决各种科学和工程问题具有重要意义。未 来，我们可以期待分光光度测定方法在更多领域的应用。
分光光度测定方法概述
分光光度测定方法是一种利用物质对光的吸收或发射特性进行定量分析的方 法。
分光光度测定方法的原理
分光光度测定方法，其中包括分光光度计的组成和 工作原理。
常用的分光光度测量技术
吸收光度法
通过测量物质对特定波长光的吸收，定量分析溶液中的物质浓度。
《分光光度测定方法》 PPT课件
这份PPT课件将介绍分光光度测定方法的背景、目标和目的，以及概述该方 法的原理和常见的测量技术，还将探讨其优点、局限性和应用领域。
课程背景
分光光度测定方法作为一种广泛应用于化学和生命科学领域的分析技术，在 实验室中发挥着重要作用。
目标和目的
我们的目标是为学生提供关于分光光度测定方法的全面了解，包括其原理、 常见的测量技术以及应用领域。
发射光度法
通过测量物质对特定波长光的发射，定量分析物质的含量和光谱特性。
优点和局限性
优点
分光光度测定方法具有高灵敏度、快速、准确、非破坏性等优点。
局限性
分光光度测定方法在测量有色溶液、浓度较高或浓度较低的物质时可能存在一些局限性。
应用领域
生命科学
分光光度测定方法在生物 医学、生化分析和生物技 术等领域有着广泛的应用。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
比色分析和分光光度法课件
分析实验结果
根据实验测量结果，进行 分析和处理，得出实验结
论。
05
比色分析与分光光度法的比较
实验原理的比较
比色分析
利用有色物质对特定波长光的吸收特性进行定量分析的方法。
分光光度法
利用物质对不同波长光的吸收特性进行定量分析的方法。
实验方法的比较
比色分析
通常使用比色皿进行实验，需要测量样品在特定波长下的吸光度。
分光光度法实验操作流程
校准仪器
在实验开始前，对仪器进 行校准，以确保实验结果
的准确性。
进行实验测量
将处理后的样品放入比色 皿中，并在分光光度计下 进行测量，记录吸光度等
光学性质。
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05
准备实验仪器
根据实验需求，准备相应 的实验仪器，如分光光度
计、比色皿等。
制备标准溶液
根据实验需求，制备标准 溶液，以便在实验中进行
比色分析的特点
比色分析具有操作简便、准确度 高、重现性好等优点，适用于各 种不同类型样品中目标物质的定 量分析。
比色分析的应用范围
食品检测
用于测定食品中的添加剂、营养 成分、农药残留等物质的含量。
化工分析
用于测定各种化学物质如有机物 、无机物、配合中各种污染物如重金属、有机物 、氮磷营养盐等的含量。
确定实验参数
根据实验目的，选择合适 的实验参数，如波长、浓 度等。
设计实验步骤
根据实验参数，设计具体 的实验步骤，包括样品的 选取、处理和测试等。
样品处理
样品选取
根据实验目的和参数，选取具有 代表性的样品。
样品处理
对选取的样品进行处理，以满足 实验要求，如破碎、溶解等。
比色法及分光光度法
比色法及分光光度法第一节一、填空题。
1.比色法及分光光度法同化学分析法比较具有___________、_____________、_____________、_______________等四个特点。
2.光的波长范围在___________称为可见光，波长小于__________称为紫外光，波长大于___________称为红外光。
3.____________通过三棱镜就可分解为____________________，这种现象称为光的色散。
4.光吸收程度最大外的波长叫做_____________，用_________表示。
5.同物质不同浓度的溶液λmax不变，具有____________的吸收曲线，不同物质具有__________的吸收曲线，可以此进行物质的___________。
6.物质呈现一定的颜色是由于___________。
7.同一物质不同浓度在一定波长处吸光度随浓度增加而________,这个特性可作为_________的依据。
二、选择题。
1.已知光的波长λ=800nm，则它应属于（）A、红光B、紫光C、红外光D、紫外光2.Fe（SCN）3溶液（红色）的吸收光颜色为（）A、红色B、黄色C、蓝色D、蓝绿色3.绿光的互补色为（）A、紫红色B、橙色C、绿蓝D、蓝绿色4.二苯硫腙的CCl4溶液吸收580~600nm范围的光，它显（）色。
A、绿色B、蓝色C、紫色D、黄色三、判断题。
1.白光是一种可见光。
（）2.同一物质不同浓度的有色溶液λmax不变。
（）3.在λmax处测定吸光度则灵敏度最高。
（）4.比色法及分光光度法同化学分析比较，准确度高，灵敏度低。
（）5.硫酸铜溶液因吸收了白光中的红色而呈现蓝色。
（）第二节光吸收定律一、填空题。
1.光吸收定律又称_______，它表明当_______________垂直通过______________，溶液的吸光度A与______________及____________成______。
分光光度法测定的操作要点
分光光度法测定的操作要点
1.准备试样：将试样称取适量，并加入所需的溶剂，使其能够溶解或悬浮。
如果需要，可以进行预处理，如过滤或离心。
2. 调整仪器：根据试样的特性和测量的波长范围调整分光光度
计的参数，如选择光路、波长、光强、检测器等。
并进行背景校正，确保测量数据的准确性。
3. 确定吸光度范围：利用标准曲线或已知浓度的标准溶液，确
定待测样品的吸光度范围。
根据吸光度值的大小选择合适的测量方法，如比色法或荧光法。
4. 进行测量：将试样注入样品池中，使其在分光光度计的光路
中通过，并记录吸光度值。
如果需要，可以进行多次测量以提高数据的可靠性。
5. 计算结果：根据已知的标准曲线或标准溶液的浓度，计算出
待测样品的浓度。
如果需要，可以进行数据处理，如平均值计算、标准差计算等。
6. 结束实验：清洗样品池和仪器，保存数据文件和记录。
如果
需要，可以将样品留存以备之后的分析和比较。
- 1 -。
8第八章 比色分析法
上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。它表示一束 单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度 和液层厚度的乘积成正比。 医学化学
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式中，K为吸光系数，当溶液浓度c和液层厚度b 的数值均为1时，A=K，即吸光系数在数值上等 于c和b均为1时溶液的吸光度。对于同一物质和 一定波长的入射光而言，它是一个常数。
T 比色法中常把I/I0 称为透光度，用T表示，
def
透光度和吸光度的关系如下：
I I0
A =－lgT
医学化学
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当c以质量体积浓度（g· ml-1）表示时，吸光系数 称为质量吸光系数，用a表示。当c以mol· L-1为单 位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示， 其单位是L· mol-1· cm-1。吸光系数越大，表示溶液 对入射光越容易吸收，当c有微小变化时就可使 A有较大的改变，故测定的灵敏度较高。一般ε 值在103以上即可进行比色分析。
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用标准曲线法时，应注意的问题：
（1）标准液的测定和被测液的测定应在相同条件 下进行。 • （2）溶液的浓度应在标准曲线的线性范围内。
•
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在测定溶液吸光度时，为了消除与被测物质吸收 无关的因素的影响，如溶剂或其他物质对入射光 的吸收，光在溶液中的散射以及吸收池界面对光 的反射等，必须采用空白溶液（又称参比溶液） 作对照。常用的空白溶液有三种： （1）溶剂空白 （2）试剂空白 （3）试样空白 P85
则
c = -lg65%/2235×2.0=4.19×10-5(mol· L-1)
分光光度法与比色法
1、几个概念：分光光度法在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
比色法colorimetry以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。
以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。
比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。
选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。
常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。
试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。
光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。
与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。
但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。
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第八章检测练习
一、填空题（每题1分，共32分）
1、单色光是的光。
复合光是的光，
2、与组成白光，故称为互补色光
3、物质的颜色：是由于物质而产生的。
4、若溶液对白光中的各种颜色的光都不吸收呈。
5、吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以为横坐标，
为纵坐标作图。
6、同一种物质对不同波长光的吸光度。
吸光度最大处对应的波长称为。
7、吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质的依据之一。
8、光吸收定律又称，它表明当垂直通过，溶液的吸光度A与及成。
其数学表达式为。
9、吸光系数K与、及有关，与无关。
10、显色反应主要有和，其中绝大多数是。
11、显色剂分为和两大类
12、目视比色法的优点是、、、、及。
二、选择题（每题2分，共18分）
1、已知光的波长为350nm，则它属于（）。
A、紫外光
B、红外光
C、蓝光
D、红光
2、硫酸铜溶液（蓝色）的吸收光颜色为（）。
A、黄色
B、红色
C、紫色
D、黄绿色
3、某有色溶液透射比为0.1，则其吸光度为（）。
A、0.01
B、1
C、0.1
D、10
4、721型分光光度计是在（）区域内使用的仪器。
A、紫外光
B、红外光
C、可见光
D、近红外光
5、721型分光光度计的比色皿的材料是（）。
A、石英
B、光学玻璃
C、彩色玻璃
D、硬质塑料
6、目视比色法的缺点（）。
A、灵敏度低
B、仪器简单
C、操作复杂
D、准确度不高
7、关于溶液的吸收曲线，下列说法正确的是（）。
A、吸收曲线与物质的性质无关
B、浓度越大，吸光系数越大
C、吸收曲线是一条通过原点的直线
D、吸收曲线的基本形状与溶液性质有关
8、摩尔吸光系数ε与质量吸光系数a的换算关系（）。
A、εa=1
B、ε=aA
C、ε=aM
D、ε=a/M
9、某吸光物质的吸光系数很大，则表明（）。
A、该物质分子量很大
B、测定该物质灵敏度高
C、该物质浓度大
D、入射光的波长很大
三、简答题（共30分）
1、什么是目视比色法？
2、比色法及分光光度法同化学分析法比较具有哪些特点？
3、造成偏离朗伯-比尔定律的因素一般可分为哪四大类？
4、显色反应的一般标准有哪些？
5、分光光度计的主要部件有哪些及作用是什么？（10分）
四、计算题（每题4分，共20分）
1、有一浓度为1.0 g/ml Fe2+的溶液，以邻二氮菲显色后，在比色皿厚度为1cm、波长510nm 处测得吸光度为0.300，计算（1）透光度T；(2)质量吸光系数a；（3）摩尔吸光系数ε。
（M Fe=55.85 g/mol）
2、钢试样1.00g溶解于酸中，用KIO3将Mn2+氧化成MnO4-，稀释至250mL，测得吸光度等于1.00×10-3mol/L的KMnO4溶液吸光度的2倍，计算钢样中Mn的质量分数w(Mn) 。
（M Mn=54.94 g/mol）
3、在λ=528nm处，用1.0cm比色皿，测得Cu2+溶液透射比为0.600，若改用2.0cm的比色皿，测得透射比T和吸光度A各为多少？
4、已配得含Fe3+的标准色阶
用同样的方法，称取含铁试样0.5000g，溶解后转移至250mL的容量瓶中，稀释至刻度。
用吸量管取出5.00mL转移至比色管中，加水稀释至25mL，其颜色深度介于三和四之间，求试样中铜的质量分数w(Cu)。