western的操作步骤Word版
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
western操作详细程序
Western blot详细步骤一、电泳1、Marker点0.8微升，72KD显红色，其它显蓝色2、100V,恒压——140V恒压，1.5h, 15%的胶，将溴酚蓝跑到外面，让带分开点。
3、转膜： PVDF膜从下到上依次是：黑板、海绵垫，两层滤纸，胶，PVDF 膜，两层滤纸，海绵垫，白板4、根据Marker把多出来的胶切掉节省。
留下14—72之间，将海绵垫与板用水洗，泡于Western转膜buffer中，剪取和脚大小合适的滤纸和膜，膜剪好后放在无水甲醇中浸泡2分钟，将滤纸润湿，两层滤纸放于海绵垫上，赶尽气泡，再铺两层滤纸，压紧夹子。
放于电转膜槽中，加冰盒，将wenstern转膜buffer倒入槽中，加满，放入4度冰箱中，100V1h, western转膜buffer可重复使用5次。
5、将膜放入封闭液中（5%脱脂奶粉，用PBS缓冲液配置）45min摇。
6、用PBST液洗膜2次，每次2min，摇（将500微升吐温20加到1000微升PBS 溶液中）将脱脂奶粉中的蛋白洗掉。
7、加一抗 Anti-His（我做的是抗His，要根据自己的蛋白选择）根据抗体说明书配置抗体稀释液，用PBS稀释，用塑料膜封膜加抗体缓冲液，封袋1.5小时反应，摇。
PBS一般PH为7.2，一抗可多次使用，直到有异味产生，可持续一个月，使用3、4次，因为比较贵，为得到较好效果，可向旧抗体缓冲液不加新液，为长久保存，可加叠氮钠，但使抗体不易结合。
脱脂奶粉可多次使用，一般为两天。
8、洗膜，4次，每次两分钟，PBST.9、加二抗，（羊抗鼠）封于小袋中摇45分钟，（二抗用辣跟过氧化物酶标记）10、PBST洗脱4次，摇11、在桌子上铺保鲜膜，将PVDF膜防御保鲜膜上，向膜上加A,B混合底物，反应1-2min，吸干底物，用保鲜膜将PVDF膜包好，放入曝光版中。
12、进入暗室操作，将胶压在膜上曝光2min（如果不行，加长曝光时间2-30min）将胶片放入显影液中2min-3min,用水漂洗一下，放入定影液2-3min（手套操作）定影液都是商品粉剂，后调配而成。
western 步骤
一。
提蛋白配RIPA (10ml配方)RIPA 9mlPMSF（100mM） 100ul10x cocktail 1ml组织剪碎，组织：RIPA=1：5~1:10，或裂解液500ul。
匀浆（过程中每个组织匀浆完清洗，夹出碎组织）。
冰上静置40min-1h，4℃ 12000rpm离心10min-15min。
取上清转移到新离心管内。
如不马上进行定量变性的话，-20℃保存，最好1周内进行变性。
BCA蛋白定量与蛋白变性配BCA液：A液：B液=50:1。
蛋白样品置于冰上。
每孔加5ul蛋白样本（组织样品稀释10倍，2ul组织蛋白样品+18ul RIPA）与100ul BCA液。
标准蛋白与样品蛋白全部加3个孔。
先加蛋白，再加BCA液，加BCA液速度尽量快，保证每孔反应时间相近。
37℃摇床30min，酶标仪读数。
设置波长562nm，标准蛋白浓度mg/ml（2，1.5,1,0.75,0.5,0.25,0.125，0.025,0）。
根据读数计算蛋白浓度，稀释。
一般稀释到1ug/ul或2ug/ul。
配200ul稀释蛋白+50ul 5x loading buffer（有剧毒，臭味，不要沾手上）。
混匀，99℃煮10min。
-20℃保存。
电泳胶板固定，检查胶板是否放平，加水检查是否漏水。
放入电泳槽内。
胶板内加新电泳液加满，胶板外可加回收电泳液，胶板外电泳液液面至少摸过胶板下缘。
拔梳子，垂直，轻。
上样：marker上两端，1ul - 2.5ul均可。
蛋白上样15ul - 25ul（根据实际情况决定），加蛋白过程要轻柔一些，不要把蛋白吹起溅落到相邻孔内。
加完蛋白后再补足新电泳液至溢出。
80V电压跑到marker分开（可以看到红色条带）。
此时可加大电压至100V或120V，也可80V跑完。
BK α大小110KD左右，GAPDH 36KD ，β- Actin 42KD。
蛋白跑到目的条带大小的marker位置与内参大小的marker位置完全分开就可以停止电泳了（至少要能分开35KD和40KD的条带）。
western的操作步骤
western的操作步骤Western Blot操作全过程一，收蛋白a（如果要收集死细胞）1.取冰，将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。
（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。
PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。
）5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
如：100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）b （如果不收集死细胞）1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。
在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。
（同上）2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。
（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。
）3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）二，测蛋白浓度BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl （A：B=50：1）。
例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。
共有11个孔。
则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。
然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。
western步骤
Western blotting 步骤一、配胶二、电泳三、转膜1、用甲醇润湿硝酸纤维素膜2、用1×transfer buffer浸泡滤纸，海绵，之后将夹板（黑色）朝下，将海绵放底部，两张滤纸，胶放在滤纸上，胶的上样孔朝下，刮走气泡，加上硝酸纤维素膜，加两层滤纸，加海绵，夹住。
3、放到转膜槽内，黑板对黑板，放入仪器带的那个小冰槽。
4、100V电压，100min，在外围加上冰，这个过程中电压会逐渐降低到80V。
四、剪膜，加一抗1、将1g 脱脂奶粉加到15ml的离心管中，加20ml 1×TBST (0.1%Tween) ，震荡混匀即为5%的milk。
2、时间到后将纤维膜取出，用丽春红染色一两分钟，水中洗一下，扫描图片后剪膜，剪去边缘多余的膜。
3、把膜放在一个小盖子中（枪头盒盖子就行），倒入配好的5%的牛奶，封闭30-40min。
4、把膜放在纸上吸一下水，放入自封袋中。
5、配一抗，GST抗体比例一般为（1:1000）即1微升抗体加到1ml TBST 中，混匀加到自封袋中，封袋子。
6、摇床上孵育两小时后可以放在4度冰箱里过夜，也可以继续下面的实验。
五、加二抗1、剪开袋子，取出膜，放入盖子中，加1×TBST，摇床上晃10min。
重复两次即洗三次。
2、加二抗，GST抗体的二抗为鼠单抗，取鼠抗2微升，加到10ml 1×TBST 中，混匀，倒入盖子中，摇床上晃1h。
3、加1×TBST洗三次，10min每次。
六、显色1、配显色液（现用现配）AP buffer 2ml /1mlBCIP 6.66微升/3.33微升NBT 13.33微升/6.66微升2、膜在水中洗一下，纸吸一下水，放到显色液中，显色大约几分钟或者时间更长。
3、扫描图片七、buffer配方1、10×running buffer2、10×transfer buffer30.3g Tris碱+144g 甘氨酸，定容到1L ddH2O中。
western步骤
1、SDS-PAGE电泳将电泳仪的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上,加满蒸馏水试漏后，准备灌胶。
按说明书配制分离胶及浓缩胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀即可灌胶。
待胶面升到适宜高度后在胶上加水封胶，隔离空气使凝胶速度加快。
分离胶凝固后，吸去胶上层的水，将剩余空间灌满浓缩胶后插入梳子。
待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两侧竖直向上轻轻将其拔出。
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中，加入足量电泳液。
按5：1比例向样品加入溴酚蓝，并于沸水中煮5 min，计算100 µg蛋白的溶液体积即为上样量。
用微量进样器贴壁吸取样品，缓缓加入加样孔中。
恒压100 V，电泳至溴酚蓝刚跑到分离胶最下端即可。
2、转膜2.1 湿转在加有转膜液的瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵、玻棒、滤纸和硝酸纤维素膜。
将夹子打开使黑面向下，在上面垫一张海绵，用玻棒赶走气泡。
在海绵垫上滤纸。
撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去。
根据marker显示，在所需分子量上下0.5 cm裁胶。
小心剥下胶条置于滤纸上并调整使其与滤纸对齐。
将NC膜盖于胶上，并在膜上盖张滤纸。
最后盖上另一张海绵垫，将夹子夹起。
整个操作在电转液中进行，并不断除去气泡。
将夹子放入电转槽中，并在夹子中加满电转液。
在电转槽中加入冰水，避免转移时大量产热。
恒流1A，电转80 min（电流及转膜时间根据分子量进行调整）。
2.2 半干转将滤纸及NC膜放入盛有半干转液的表面皿中，使NC膜充分浸透。
半干转仪上放滤纸，铺上NC膜，将胶置于膜上并赶气泡，最后盖上滤纸，将夹子夹起，装好仪器，调电流及转膜时间，转膜。
转膜电流=[NC膜（2×8cm）个数×0.04]A;转膜时间=（分子量+3）min（转膜时间根据转膜情况可上下调整）。
3 免疫反应将膜用washing buffer洗涤5 min后，移至含有封闭液的表面皿中，在脱色摇床上摇动封闭3 h。
从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于一抗液面上。
完整word版,Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Western blot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。
二、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作步骤（一）样品处理1培养的细胞：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
或收取细胞于EP管中加入适量的1×SDS，吹匀，100度5min,重复一次。
1200rpm ,10min.取上清定量。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
western印迹法原理和流程
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western blot全过程doc
western blot全过程如下：1.SDS-PAGE试剂的配制（1）30%丙烯酰胺溶液: 称取29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml去离子水中温热,使之充分溶解,放置于棕色瓶中保存；（2）10%SDS溶液称取SDS10g, 加入100ml蒸馏水,微热溶解；（3）10%过硫酸铵称取0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水,临用前配制；（4）三羟甲基氨基甲烷(Tris)-甘氨酸电泳缓冲液(PH8.3):1*Tris-Gly去离子水900mlTris碱 3.02g甘氨酸18.8g10%SDS 10ml用去离子水补至100ml注：一般配制成5*或10*保存（5）浓缩胶（upper gel）缓冲液(1.0mol/L PH6.8 Tris-HCl缓冲液): 称取12.11gTris,加入60ml蒸馏水,使之溶解,用HCl调至PH6.8,再加蒸馏水至总体积100ml；（6）分离胶（low gel）缓冲液(1.5mol/LPH8.8Tris-HCl缓冲液): 称取Tris18.165g先用60ml 蒸馏水溶解,加入HCl调至PH8.8,最后加水补至100ml。
2. 凝胶的灌制及电泳（同时制备两块胶，一块染色一块转膜）（1）制备浓度为12%（改为15%，见附录一）的分离胶5ml(改为15ml，见附录一)去离子水1.6ml30%丙烯酰胺溶液2.0ml1.5mol/L PH8.8Tris-HCl缓冲液1.3ml10%SDS 0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED 2ul(2)速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液,预留1.5cm灌注浓缩胶, 应排除凝胶底部玻璃板间的气泡.用吸管在丙烯酰胺溶液上层轻轻覆盖双蒸水（异丙醇效果更佳）, 将凝胶置于室温（30min）；(3)分离胶聚合后倾出覆盖液体,并用滤纸吸净残留液体；(4)制备浓度为5%的浓缩胶2ml(改为6ml，见附录一)；去离子水1.4ml30%丙烯酰胺溶液0.33ml1．0mol/L PH6.8 Tris-HCl缓冲液0.25ml10%SDS 20μl10%过硫酸铵20μlTEMED 2μl(5) 在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶, 立即插入梳子,避免气泡产生；(6) 当浓缩胶聚合的同时,将蛋白抽提液和加样缓冲液在沸水中加热5分钟,使蛋白变性；(7) 浓缩胶聚合后小心拔出梳子,立即用去离子水洗涤加样槽,以除去未聚合的丙烯酰胺；(8) 电泳槽中加满电泳缓冲液（ph8.3的Tris-Gly）,用微量加样器向加样槽中加入样品和分子量蛋白质标准(Markers)；(9) 电泳装置与电源相连,凝胶上所加电压50V,当染料前沿进入分离胶后,把电压提至100V,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部,关闭电源。
western 流程
试剂：1、30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺；2、4×Tris•Cl/SDS；3、4×Tris•Cl/SDS, pH6.8；4、4×SDS电泳缓冲液；5、TEMED；6、10%过硫酸铵；7、DAB显色试剂盒；8、抗体试剂盒1、将血管放入AP管中，用冷PBS洗涤，剪碎，加入1mL裂解缓冲液（预冷至0℃)）在组织匀浆器上0℃匀浆，匀浆后，冰上放置30 min,10 000 r /min 4℃离心5 min,取上清液少许测蛋白含量,剩余上清液按蛋白量相同上样。
用8%分离胶分离,进行不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜操作。
2、电泳：1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。
2）配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。
样品体积少于10μl不需灌制积层胶。
4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。
让凝胶在室温聚合30min聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。
5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。
6)配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。
7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。
让积层胶室温聚合30min。
8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。
如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100µl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。
Westernblot操作步骤[完整版]
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Westernblot操作步骤[完整版]Western blot 操作流程作者：孙雪纯审核人：关宝生发布者：王建宇实验原理：Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
内参:WB过程监测以及目的蛋白定量的标准;最重要和最不可或缺的对照就是内参照。
1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下）,那么这个体系就是存在问题的；2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；内参名称分子量大小适用范围beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒体COXIV 16kDa 线粒体TBP 38kDa 细胞核实验步骤一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）第一步：法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。
法（2）实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，来回磨，至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。
注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。
Western+实验操作程序
Western blot 实验操作程序一、储存液的配制：1.)1.5M T ris-HCl（PH8.8）：100mlTris 18.15g去离子水50 ml缓慢加浓盐酸调PH至8.8（约4 ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml.2.) 0.5M T ris-HCl（PH6.8）：100mlTris 6.05g去离子水50 ml缓慢加浓盐酸调PH至6.8（约8ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml..3.)10%SDS（W/V）：100mlSDS 10g去离子水100 ml溶解后，室温下保存。
4.)50%（v/v）甘油：100ml100%甘油50 ml去离子水50 ml 混匀后，室温下保存。
5. )1%溴酚蓝：10 ml溴酚蓝100mg去离子水10ml搅拌至完全溶解，经过滤后使用6. )丽春红S(Ponceau S)储存液：100 ml丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g去离子水100ml混匀后，室温下保存。
7. )10×转膜液：1000 ml甘氨酸90gTris 19.3g加去离子水至1000 ml，PH在8.3-8.4左右.二、工作液的配制：PMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。
它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成10 mg/ml的储存液，需用异丙醇溶解）。
Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。
丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。
搅拌至完全溶解，在4o C下可保存数月。
4. 4⨯分离胶缓冲液：100 ml2M Tris-HCl（PH6.8）75 ml 1.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水21ml混匀后可在4o C下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4⨯的缓冲液即可5. 4⨯堆积胶缓冲液: 100 ml1M Tris-HCl（PH6.8）50 ml 0.5M10%SDS 4ml 0.4%去离子水46ml混匀后可在40C保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4⨯的缓冲液即可6. 10%过硫酸胺(APS)：5 ml过硫酸胺0.5g去离子水5ml分装后，保存于-200C7. 电泳缓冲液:1000 mlTris 3g 25 mM甘氨酸14.4g 192 mMSDS 1g 0.1%加去离子水至1000 ml，PH在8.3左右。
western实验步骤与注意事项
葵花宝典致亲爱的师弟师妹：本着不希望你们来到实验面临一些束手无策的窘境，师姐在这里把自己所学和资源略写一二。
一、来到实验室，无论你喜欢不喜欢，乐不乐意，一定要把实验室的师兄师姐的名字都记住，以及实验室里有什么仪器！！！二、关于实验部分1、组织蛋白提取：方法一：（1）4℃下，先生理盐水洗，再加入蛋白提取液，剪刀剪碎，匀质器6000，循环六次，每次都拿下来冰镇，防止蛋白变性，最后14000转，20min，4℃（2）跑western之前，需测BCA，以保证每个组分上样的蛋白总质量一样（此处为定量实验，看目标蛋白的表达量，若仅仅定性则无需做BCA）注意事项：匀质器需要用的小管和玻璃球在郝荣华师姐那里，先加玻璃球一般，目测大概三四毫米高度就行（包括管底小尖尖），且溶液必须装满才振荡效果好，因此，加入细胞裂解液多，容易导致蛋白浓度低。
方法二：（1）取冰（东边实验室，最后面有制冰机）（2）将软骨从﹣80℃冰箱取出，置于冰面上解冻（3）去细胞室的液氮罐里，取出少量液氮置于泡沫箱内，（4）转移至实验室内，取出少量，倒入研钵中，研磨（5）浆糊状，立即转入EP管中，（6）细胞裂解液，2、western blotting（1）抗体购买1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下.2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系。
一抗来源必须要和二抗搭配,且不能和样本来源相同。
比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学，负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多一般都找得到了（2）β-actin（内参蛋白）分子质量为43KD，因此，目标蛋白不能和内参蛋白分子质量一致，内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有β-ACTIN，GAPDH等。
western实验步骤
western实验步骤Western实验步骤西方实验法（Western blotting）是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来检测目标蛋白在复杂混合物中的存在以及其相对丰度。
本文将介绍Western实验的步骤。
1. 样品制备需要从细胞或组织中提取蛋白质。
可以使用细胞裂解液或蛋白质提取缓冲液来裂解细胞，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，使用离心等方法将细胞碎片与其他细胞组分分离。
最后，将得到的蛋白质溶液进行浓缩和纯化，以获得高质量的蛋白样品。
2. SDS-PAGE电泳将样品中的蛋白质按照其分子量大小通过SDS-PAGE电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在加热后进行电泳。
电泳时，将样品注入凝胶孔中，并在电场作用下进行分离。
蛋白质在凝胶中的移动速度受到其分子量的影响，较小的蛋白质迁移得更远。
电泳结束后，用染色剂染色来可视化蛋白带。
3. 转膜将电泳后的蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便进行后续的免疫检测。
通常使用半干法或湿法转膜的方法。
在半干法中，将电泳片与膜和吸收纸堆叠在一起，用电流将蛋白质转移到膜上。
在湿法中，将电泳片和膜分别浸泡在缓冲液中，并通过电流进行转膜。
转膜完成后，可以通过Ponceau染色来验证转膜效果。
4. 阻断和抗体处理为了减少非特异性结合，需要在膜上进行阻断处理。
常用的阻断剂包括非脂类干乳或BSA。
将膜浸泡在阻断液中，以阻断未结合的蛋白质结合位点。
然后，将膜与目标蛋白特异性的一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验的目的和样品的特点来确定。
将膜与抗体孵育一段时间后，用缓冲液洗涤膜以去除未结合的一抗。
5. 二抗检测在处理完一抗后，需要使用与一抗来源物种不同的二抗来检测目标蛋白的存在。
二抗一般是与酶或荧光标记结合的抗体。
将膜与二抗进行孵育，并再次用缓冲液洗涤膜以去除未结合的二抗。
然后，使用适当的检测方法来可视化目标蛋白。
6. 结果分析根据实验目的和所用的检测方法，可以使用化学发光、荧光成像或酶标记等技术来检测和量化目标蛋白的存在。
Western(试剂配制和操作步骤)
Western（试剂配制和操作步骤）试剂配制：（一）母液（二）使用液操作步骤：（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三） SDS －PAGE电泳（四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影，定影（七）凝胶图象分析这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris•HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml10％SDSSDS 10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
20％Tween20Tween20 20ml蒸馏水至100ml混匀后4℃保存。
（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L Tris•HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100?g/ml PMSF）：1mol/L Tris•HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX－100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后，4℃保存。
Western实验步骤
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
(完整word版)Western操作步骤
Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）from 生物问问我的生物博客Western操作步骤（一）蛋白样品制备(1）单层贴壁细胞总蛋白的提取:1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0。
01M pH7.2～7。
3)。
平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。
重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液.将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3。
按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM),摇匀置于冰上。
(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5。
裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1。
5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）6。
于4℃下12000rpm 离心5min。
(提前开离心机预冷)7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。
（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液,按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的.本人是先用预冷的PBS（一般数毫升)加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强)（2）组织中总蛋白的提取:1。
将少量组织块置于1～2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。
然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎.4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1。
western 实验操作流程
免疫印迹实验操作流程一、培养细胞总蛋白质的提取1. 每200ul预冷的RIPA裂解液中加入2ul PMSF，混匀后置冰上备用；2. 收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸干上清；3. 每106个细胞加100ul预冷的RIPA裂解液，与细胞充分混匀，置4℃条件下放置30m，每间隔5分钟吹打混匀；4. 4℃，12000rpm条件下离心5m，将上清转移入另一预冷的离心管中；5. 使用蛋白定量试剂盒及酶标仪对总蛋白质进行定量测定；调整蛋白浓度；6. 依据体积加入6×蛋白上样缓冲液（如不立即使用，置于-80℃待用）；沸水浴煮沸5分钟后准备上样。
二、电泳与转膜7. 清洗玻璃板，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%分离胶和5%积层胶）；8. 蛋白提取液与预染蛋白分子量Marker上样，100V电泳；9. 依据实验要求剪出合适大小的PVDF膜，甲醇漂洗PVDF膜10s，并使用电转液完全浸润PVDF膜、胶板、海绵、滤纸15m；10. 剥胶后，根据预染蛋白分子量Marker确定目的条带的位置并切胶；11. 按阴极至阳极：海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将转膜板固定于装满电转液的电转槽中，90V电转；12. 电转结束后，在膜上做标记；三、封闭、一抗与二抗孵育、显色13. 将膜条置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温缓慢振荡封闭1h；14. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗中：抗β-actin小鼠抗人单克隆抗体（1:4000），置4℃条件下缓慢振荡过夜（或室温振荡2h以上）；TBST 液洗膜三次，每次10min；15. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的二抗中：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1:4000），室温缓慢振荡1h；TBST液洗膜三次，每次10min；16. 加入配制好的化学发光试剂ECL，室温2min后，X光片曝光、显影、定影。
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Western Blot操作全过程
一，收蛋白
a（如果要收集死细胞）
1.取冰，将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量
的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。
（1×Cell Lysis Buffer：
PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。
PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。
）
5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，
15min。
6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
如：100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）
b （如果不收集死细胞）
1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。
在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。
（同上）
2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。
（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。
）
3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）
二，测蛋白浓度
BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）
1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋
白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A：
B=50：1）。
例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。
共有11个孔。
则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。
然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。
（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000）
3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。
4.用酶标仪测蛋白浓度。
5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。
例：蛋白浓度为
1000，需上样15μg。
则需上样15÷1000=？上样量不超过20μl。
三，配胶
1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。
（板必须擦干净，
下端对齐，否则容易漏胶。
）
2.配分离胶，根据要跑的蛋白分子量，配相应浓度的胶。
3.快速将分离胶加入薄厚板之间，不能太满，留出浓缩胶的部分。
(浓缩胶高度大约1CM)
4.在分离胶上灌水，要缓慢，为了让胶凝的更好。
5.30分钟左右，分离胶凝了，将水倒掉，滤纸吸干，找好梳子。
制
浓缩胶。
6.灌胶，快速插入相应的梳子。
7.约15min胶可以凝固。
四，煮蛋白
1.煮蛋白前将蛋白中加入6×SDS+DTT(即上样缓冲液)。
例样品蛋白
共有100μl，则需加100÷5=20μl 6×SDS+DTT。
混匀。
（加有DTT的SDS应-20°C保存。
DTT应-20°C保存。
SDS：DTT=9：1）。
2.将蛋白沸水煮10min。
煮过的蛋白在两周内有效。
五，上样，跑胶，转膜
1.电泳巢内加入电泳液，夹好胶板。
拔去梳子。
2.每孔上样量不超过20μl，每块胶应上有Maker。
剩余的孔里上1
×SDS。
3.蛋白上样前要震荡混匀。
4.浓缩胶80V，分离胶120V。
5.转膜
半干法转膜或者湿转自己的试验条件决定。
根据分子量的大小，按照Maker的位置裁胶，根据胶的大小，剪相应大小的NC膜。
（NC膜要先用甲醇活化）。
六，封闭
5%牛奶（TBST稀释的脱脂牛奶）室温封闭1-2h，
七，封一抗
摸清抗体要用的浓度。
用TBST或5%牛奶加抗体。
室温1-2h，或4°C过夜。
用过的抗体要回收，做记号，用的第几次。
放入-20°保存。
八，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。
（一抗不要摇的太剧烈）
九，封二抗
摸清二抗的浓度。
室温45min-2h。
抗体回收，做记号，用的第几次。
放入-20°保存。
十，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。
（二抗可以摇的稍快些）
十一，发光
1.在发光板内放入干净的可以夹住NC膜的薄膜，放好已经洗好
的膜。
用滤纸吸干膜上的水。
2.拿齐发光板，发光液，1ml的枪及枪头（至少两根），胶片，一
张滤纸，一个离心管。
3.进入暗室，反锁好门，开红灯，在离心管内配发光液，A液：B
液=1：1。
先A后B。
切记换枪头，打开薄膜，将AB液混匀，均匀的洒在NC膜上。
盖上薄膜，将多余的发光液推开，以防水多膜移动。
漏出薄膜外的可用滤纸吸干。
4.关灯，看见荧光，盖上胶片。
胶片盖上之前先在左上角（个人
习惯）折个角，好辨认方向。
5.根据荧光强度按压几秒或几分钟。
将胶片放入洗片机冲洗。
6.等片子完全洗好，可开灯。
或者DAB显色需要买试剂盒。
十二，扫描保留结果
（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。