Western操作步骤

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Western Blot技术详细操作步骤

Western Blot技术详细步骤

蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。Western Blot基本步骤如下：

1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。前处理样本并测定蛋白质浓度。准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。

2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。

3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯（PVDF）或者硝酸纤维素膜。使用电转印或半干转印设备进行转移。

4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。

5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释（通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。

6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。

7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。孵育时间需要优化。

8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。重复步骤6的清洗方法。

9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。等待信号产生并记录结果。测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。

Westernblot实验操作步骤

Western blot实验步骤

一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）

1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。

2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。

3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.

4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）

常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心

5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。

二、蛋白浓度测定(BCA法)

BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

WB实验步骤

Western Blotting操作步骤

一、蛋白样品制备

（1）细胞总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬

浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。

2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰

上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。（整个操作尽量在冰上进行，保持

低温。）

3、4℃下12000rpm离心15min。（提前开离心机预冷）

4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。

（2）组织总蛋白的提取：

1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织

尽量碾碎至无明显组织碎块。

3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保

存。

二、蛋白含量的测定

1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成

25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。

2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。

3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。

4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。

5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。

Westernblot实验操作详细步骤

1.样本制备：

a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。

b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。

c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

2.蛋白质分离：

a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。

b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。

3.蛋白质浓度测定：

a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。

b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。

4.准备SDS-凝胶：

a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。

b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。

c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。

5.蛋白质电泳：

a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。

b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。

c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的

确定。

d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。

6.蛋白质转膜：

a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。

b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。

c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。

7.阻塞和抗体孵育：

a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。

b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。

c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。

8.洗涤：

a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。

b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。

WB实验步骤详解

Western实验步骤

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。

1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。

Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤

随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。

Western blot实验技术全攻略

第一步：制备样品

Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。

第二步：电泳分离蛋白质

将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。

第三步：转移蛋白质

将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。

第四步：阻断和孵育

将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。

第五步：检测和成像

将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。

western blotting的基本操作过程

western blotting的基本操作过

程

Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。

一、材料准备

在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。

此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。

二、电泳分离

Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。

将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。

三、转膜

将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。

western 操作步骤

Western 操作步骤

（三）SDS——PAGE电泳

（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。

（2）灌胶与上样

1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边）

2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。

3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。

4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。

5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。

6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。

7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul

western blot 超详细步骤

一、蛋白质的样品制备：

一、溶液：

裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）

二、操作步骤：

1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。

2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。

3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。

二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）

1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。

2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。测出待测蛋白浓度。测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。样品于-80℃保存。

三、电泳

1.制胶

分离胶:

电泳凝胶浓度

试剂 10%

H2O(ml) 4.0

30%丙烯酰胺 3.3

1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)

2.5

10%SDS(ml) 0.1

10%AP(ml) 0.1

TEMED(μl) 5

western blotting实验操作步骤讲解

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第一部分：蛋白样本提取制备

蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：

1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提

取方法或选择不同的试剂盒产品）；

2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂

等的选择）；

3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋

白酶和磷酸酶抑制剂）；

4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策

略）；

5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

方法的选择

◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；

◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。

Example 1：

实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：

1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；

2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需

的量，临用临配）；

3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分

裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。

western的操作步骤

W e s t e r n B l o t操作全过程一，收蛋白

a 如果要收集死细胞

1.取冰,将4°C离心机提前降温。

2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍,用适量的

胰酶消化,用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来,收集到离心管,室温离心1000rpm,5min。

3.弃上清,将离心管倒扣在滤纸上,尽量吸尽残留上清。

4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。 1×Cell Lysis Buffer：

PMSF=100：1,1×Cell Lysis Buffer,PMSF-20°C保存。PMSF常温易降解,拿出时间不得超过30min,必须放置冰上。

5.冰上裂解15min,将裂解液转移至EP管离心,4°

C,12000rpm,15min。

6.小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。如：100μL。

7.将收集好的蛋白保存与—20°C。可长期保存

b 如果不收集死细胞

1．弃上清,孔板PBS洗1-2遍,吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。同上

2．冰上裂解15min,用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。不同的孔不能用同一个刮子,刮前用水冲洗,擦干。

3．将裂解液转移至EP管离心,4°C,12000rpm,15min。

4．小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。

5．将收集好的蛋白保存与—20°C。可长期保存

二，测蛋白浓度

BCA法或者按照自己的试剂盒说明操作

1.需96孔板,测蛋白浓度的A液,B液,标准蛋白,要测的样品蛋白。

2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液,每孔需AB混合液80μl A：

WesternBlot操作步骤

1.样品处理：

-收集样品：从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。

-破碎细胞：使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。

-甲醇沉淀：向破碎细胞中加入冷甲醇，以沉淀蛋白质，并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下，使形成沉淀物。

-洗涤：使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物，去除甲醇等杂质。

-干燥：在室温下或低真空下干燥蛋白质沉淀物，以去除水分。

2.SDS-：

-制备凝胶：根据待分离蛋白的大小范围选择合适的凝胶浓度，如8%-12%聚丙烯酰胺凝胶。

- 制备样品：将样品加入样品缓冲液，如Laemmli缓冲液，并将其煮沸，以使蛋白质样品被变性和解聚。

-样品加载：将样品以适当的体积加载到凝胶孔中。

-电泳：将凝胶浸泡在预冷的电泳缓冲液中，并进行电泳（通常为100-200V），直到样品达到所需的分离程度。

-目视观察：在电泳结束后，可以通过染色或蛋白质染色来可视化分离的蛋白质带。

3.电转印：

-制备膜和垫纸：将两张蛋白质转移膜和一片垫纸切割成与分离凝胶相同大小的形状。

-准备电转印池：将电转印池中的电转印缓冲液注满，并将蛋白质转移膜、垫纸和凝胶按顺序放入电转印池中，保持它们之间的紧密接触。

-转印：应用恒定的电流（通常为300mA）进行电转印，以将蛋白质从凝胶转移到膜上，通常需要1-2小时。

-验证电转印的效果：将凝胶和膜进行一致性染色或蛋白质染色，以判断蛋白质是否转移到膜上，是否均匀。

4.膜上抗体反应：

-阻断：将膜放在牛血清蛋白（如5%脱脂奶粉）或胶原蛋白（如2%BSA）的阻断缓冲液中，以阻止非特异性的抗体结合。

Western印迹法原理、操作步骤及应用

Western印迹法的原理及应用

一、原理

免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分

析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

二、材料

Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。

三、操作步骤

（一）样品制备

培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆

0.5～1分钟。细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。

（二）SDS-PAGE

聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。SDS-PAGE

是最常用的凝胶电泳技术。它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

Western(试剂配制和操作步骤)

Western（试剂配制和操作步骤）

试剂配制：（一）母液（二）使用液

操作步骤：（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三） SDS －PAGE电泳（四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影，定影（七）凝胶图象分析

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

（一）母液

1.0mol/L Tris•HCl

Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

10％SDS

SDS 10g

蒸馏水至100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺0.1g

超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）

Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

Western-blot的原理、操作及注意事项

Western blot的原理、操作及注意事项

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备

A：样品的制备

1 组织：

组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

2 细胞：

细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。

B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因

1.双缩脲法：

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western

Blot）是将蛋白质转移到膜上,

然后利用抗体进行检测的方

法。对已知表达蛋白，可用相

应抗体作为一抗进行检测，对

新基因的表达产物，可通过融

合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交

方法类似，但Western Blot采

用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，

被检测物是蛋白质，“探针”是抗

体,“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样

品，转移到固相载体（例如硝

酸纤维素薄膜)上，固相载体以

非共价键形式吸附蛋白质,且能

保持电泳分离的多肽类型及其

生物学活性不变.以固相载体上

的蛋白质或多肽作为抗原，与

对应的抗体起免疫反应，再与

酶或同位素标记的第二抗体起

反应，经过底物显色或放射自

显影以检测电泳分离的特异性

目的基因表达的蛋白成分.该技

术也广泛应用于检测蛋白水平

的表达。

实验材料蛋白质样品

试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒

仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒

实验步骤一、试剂准备

1. SDS—PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验.

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）1。0 ml；10％SDS 6.0 ml；β—巯基乙醇0.2 ml；

ddH2O 2.8 ml。

3。转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g；Tris 5。8 g；SDS 0。37 g；甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。