Western_blot_试剂配制及操作流程
Western blot 试剂与操作步骤
[主要试剂]1、SDS-PAGE 试剂：2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O 至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。
7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。
[操作步骤]1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g 离心15min。
取上清液作为样品。
2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。
转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
Western-blot实验操作步骤
Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
Western-blot操作
Western-blot一、配胶。
1.刷洗玻璃板，夹紧于架子上，架至板架上，加水检漏；2.准备试剂。
30%丙烯酰胺（4℃冰箱放）、H2O、1.5M Tris(6.8,8.8) 、10%APS、TEMED3.按配方配胶。
（配方在配胶区），先配下层胶，每块胶按10ml 量，TMED最后加，加完后混匀立即倒胶，超中间绿色标志处一点点，水封，约半小时凝固，再配上层胶，每块胶按5ml 量，先将水层倒掉，用滤纸吸干，用枪头将上层胶注入，插入梳子，待凝。
注意孔中不要产生气泡。
二、蛋白定量（考马斯亮蓝法）。
1.按1：4用水稀释5×考马斯亮蓝，即60：240（水）（每管样本需300úl 1×考马斯亮蓝，[标本数+6个标准样品+1（备用）]×300=需要配的1×考马斯亮蓝总体积。
2.将稀释好的考马斯亮蓝分装于1.5mlEP管，每管300úl；3.标准曲线的建立。
6个标准样品管各加入1ug/mlBSA体积为0、1、2、3、4、5ul，加入待测样本1ul(预先离心，至少12000rcf,10min,将上清移至新EP管)，涡旋混匀。
（酶4.各取200ul混合液于96孔板中，上机测待测蛋白浓度。
标仪的使用）5.蛋白变性（变性完蛋白样本浓度为1ug/ul）。
先换算需要变性的蛋白，例如，需要变性50ug蛋白样，即变性完的样本总体积=50ul,则需要加的未变性的蛋白样体积(ul)=50ug/测得蛋白样浓度;变性完的蛋白样体积（总体积）：4×loading buffer(β-巯基乙醇)=4：1，即每个蛋白样变性时加入的4×loading buffer(加二-巯基乙醇)的体积是一样的，即12.5ul,其余体积用Basic lysis buffer 补齐，即50-未变性的蛋白样体积(ul)- 4×loading buffer(加β-巯基乙醇)的体积（ul）,100℃，5min.(若没用完，可存放于-20℃)。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Westernblot试剂配制及操作流程
cooktail 。
Western-Blot 操作流程试剂配制1.RIPA 裂解液:10mM Tris (,)1%NP40%Trit on X-100% 兑氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘 油调pH 值至。
混匀后4 C 保存，长期保存于-20 C 。
使用时，加入蛋白酶抑制剂制胶用（1-6）:1. L Tris • HCI （）Tris 12.114g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
2. L Tris • HCI （）Tris 18.671g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
3. 10 % SDSSDS 10g蒸馏水至100ml如溶解困难，可在50C水浴下溶解，室温保存如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用4. 10 %过硫酸胺（AF）过硫酸胺蒸馏水1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4C保存，保存时间为1周）5. 四甲基乙二胺原液（TEME）4?C保存。
6. 30初稀酰胺:4?C保存。
胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定10%F层胶，即分离胶（两块胶，15ml):依次加入去离子水30%^烯酰胺5ml1.5M Tris-HCI()10%SDS150口 I10%AP150口 ITEMED6口I每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEME量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）:依次加入去离子水30%丙烯酰胺1ml1M Tris-HCl ()10%SDS 60 口l10%AP 60 口lTEMED 6 口l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEME量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。
7. 5X电泳液缓冲液Tris () 15.1g甘氨酸（）94gSDS （先加甲醇5.00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释5倍，通常取160ml 配制成800ml 即可。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Western blot 试剂配制及实验步骤
Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验
蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
westernblot操作规程-相关试剂配制
westernblot操作规程-相关试剂配制8SDS-PAGE电泳适⽤与Bio-Rad Mini Protean 3类电泳槽⼀、准备⼯作1 试剂蛋⽩marker；丙烯酰胺；双丙烯酰胺；Tris碱；⽢氨酸；甲醇；冰⼄酸SDS；过硫酸铵；⽢油；溴酚蓝；β-巯基⼄醇；考马斯亮蓝R-250；TEMED；正丁醇2仪器与耗材电泳系统；移液枪；电⼦天平；pH计；恒温加热器；EP试管；量筒（500ml,250ml,100ml,20ml）；烧杯（500ml,50ml）；玻璃引流棒；储液瓶；⼆、操作步骤a.灌制分离胶(6cm×8cm×1.5mm):1. 组装好凝胶模具，确保不会发⽣凝胶渗漏。
2. 凝胶配制所⽤组分如下：按10%配制（注：先加⼊○1○2○3○4，然后再从冰箱取出○5○6加⼊）3. 加⼊○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。
（注：⼀定要将加⼊的溶液充分混匀，以免胶凝固的不均匀）4. ⼩⼼地⽤移液器将分离胶沿隔⽚加⼊模具。
（注：动作缓慢，以免产⽣⽓泡）5. 当加⼊的凝胶溶液7.4 mL时，轻轻在溶液上覆盖⼀层1 mL正丁醇饱和的⽔，使胶⾯平整。
6. 等40 min，待凝胶聚合后，在分离胶和⽔之间会出现⼀个清晰的界⾯。
（注：此时可制备蛋⽩样品。
具体见“c. 样品的制备”）b. 灌制浓缩胶1.浓缩胶配制所需组分如下：按3.9%配制2.倒出并⽤滤纸吸⼲覆盖在分离胶表⾯的⽔层。
（注：先加⼊○1○2○3○4，然后倒出⽔，最后再从冰箱取出○5○6加⼊）3.加⼊○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。
4.⼩⼼地⽤移液器将浓缩胶沿隔⽚加⼊模具，直⾄凝胶到达模具的顶部。
5.斜着插上梳⼦。
（注：动作缓慢，尽量不要产⽣⽓泡）6.放置30 min左右，待凝胶聚合后，⼩⼼拔出梳⼦。
（注：拔出梳⼦时，要垂直拨出，以免损坏制好的泳道）7.将凝胶放⼊电泳槽中，在槽中加⼊1×电泳缓冲液。
Western_blot操作流程08.24
Western-Blot操作流程（一）蛋白样品制备1、倒掉培养液，向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min2、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中（注意冰上操作）3、于4℃下12000rpm离心5min。
4、将离心后的上清分装转移倒1.5ml的离心管中放于-80℃保存。
（二）蛋白含量的测定1. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。
配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。
2. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。
例如取20μl 25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。
3. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
例如5mlBCA试剂A加100μlBCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。
BCA工作液室温24小时内稳定。
4. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。
5. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。
6. 各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30分钟。
注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。
7. 测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。
根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度（三） SDS－PAGE电泳1、清洗玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。
加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。
放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。
随后轻轻加3ml乙醇液封页面。
静置30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。
取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。
（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。
2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。
(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
WesternBlot配方和方法
Western Blot 配方和方法Western Blot配液：1.10% SDS 溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH O 1ml2加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。
2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH O 1ml2由于过硫胺酸会缓慢分解，最好颖配制，或隔周配制〔也可每 200 微升 EP 分装，4℃保存 4W，-20℃保存 1 月〕3.1× 电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至 1000ml，调整PH 8.3。
冰箱内可保存数月。
4.10 ×转膜液〔储存液〕甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH O 400ml2加水至 500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。
1 × 转膜液 1L 配制：10 × 转膜液储存液 100ml，150ml 甲醇，加 DDH O2 750ml，PH 8.5，定容至总量 1L5.1×转膜液〔现配现用〕：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至 1000ml6.10 × TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整 PH 至 7.6 后定容至500ml 7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml温度适当调整〕〔pH6.8〕配胶：先配分别胶，再配积层胶。
一般两者同时配制，只是最终分别胶先加TEMED 混合后马上灌胶，而积层胶放4℃，等分别胶凝固后再加TEMED 混匀后灌胶。
TEMED 量加大，一般加至原来的2-3倍，依据试验当时的2ml 3ml 5ml 5ml 10% 5ml 5% 5% 8% 10% 两 15% 积 积 分 分 块 分 层 胶 层 胶 离 胶 离 胶胶 离胶超纯水1.42.1 2.3 1.9 2.8 1.1530％Acr/Bic0.3 0.4 1.3 1.7 2.5 2.539551.5mol/L1.3 1.3 0.9 1.3Tris · HCl5 〔pH8.8〕1mol/L 0.2 0.3Tris · HCl 5 75〔为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和10％SDS 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0235575 5 10%APS〔过硫胺0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 酸〕235575 5TEMED 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.002 03 03 02 03 02 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29 配制时，SDS- 有效分别范围凝胶浓度〔％〕线性分离范围〔KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分别的蛋白质分子大小选择适宜的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于 60～200kDa 的 SDS变性蛋白质分子的分别，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。
Western blot实验流程
Western blot一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。
二.药品配制：1.TBS×10(Tris Buffered Saline)：2.42 g Tris base8g NaCl100ml H2O, 用HCl调pH 7.6，4°C保存.(配TBST用)TBST=TBS+0.05%Tween 2．TBS：0.303 g Tris base0.4383g NaCl (150mM)0.05gSDS用HCl调pH至8.0(配裂解液用)，50ml约用2.1mlHCl。
3．0.5M Tris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4℃保存。
(若调小了，用5.6%NaHCO3调回) 。
1.5M Tris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4℃保存。
4．5×Running buffer pH8.3,500ml：Tris-base 7.5g,Glycine(甘氨酸) 36g,SDS 2.5g加灭菌水至500ml, 4℃保存,用时若有沉淀析出可提前拿出置37℃，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Running buffer加入240ml水。
5．30%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：8.76g acrylamide, 0.24g N, N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml 。
用0.45 µm的过滤器过滤后4°C避光保存6．10%SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶，需较长时间)，常温保存。
(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western-blot实验所需试剂配制方法
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 18.17 80ml 2.8-3ml
--
色瓶中 4℃保存，
（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）
2. 10％（W/V）过硫酸铵：
名称
用量 备注
过硫酸铵
0.1g
去离子水
1ml
现配现用
（注意：10％过硫酸铵溶液在 4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）
3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 1MTris-HCL, pH=6.8 SDS 甘油 BPB（溴酚蓝） 超纯水
2ME
用量
1.25ml 0.5g 2.5ml 25mg 至 5ml 50℃充分溶解， 30min，离心取上 清，0.45uM 过滤 10ul/200ul
2.5ml 1g 5ml 50mg 10ml
备注
分装 200ul/管 使用前添加，添加后可室温 保存一个月
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
备注 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
ห้องสมุดไป่ตู้--
--
缓冲液配置：
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)
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Western-Blot操作流程
试剂配制
1.RIPA裂解液：
10mM Tris（MW121.14，PH7.5）
1%NP40
0.5%TritonX-100
0.2%脱氧胆酸钠
2 mM EDTA
1 mM PMSF
20%甘油
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
制胶用（1-6）：
1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）
Tris (MW121.14) 12.114g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。
2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 18.671g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
3.10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）
5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml
30%丙烯酰胺 5ml
1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml
10%SDS 150μl
10%AP 150μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡
5%上层胶（两块胶，6ml）：
依次加入去离子水 4.1ml
30%丙烯酰胺 1ml
1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml
10%SDS 60μl
10%AP 60μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
7．5X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14） 15.1g
甘氨酸（MW75.07） 94g
SDS 5.00g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。
8．10X转膜缓冲液
甘氨酸（MW75.07） 151.1g
Tris（MW121.14） 30.3g
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。
通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。
（先加甲醇易产生沉淀）9．10XTBS缓冲液
Tris（MW121.14） 24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏水至 1000ml
（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。
10．1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液 100ml
蒸馏水 900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。
溶解后室温保存。
11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
1XTBST缓冲液 95-100 ml
脱脂奶粉 5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。
步骤：
SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2、按前面方法配12％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在7ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶后胶上加
一层异丙醇醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
弃去异丙醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。
4、等待胶凝期间可计算含10-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）
取出上样样品至EP管中，加入5×上样缓冲液至终浓度均为1×。
上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。
5、按前面方法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插
入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。
等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样
Marker 7μl
样本根据自己的样品决定
实验所用Thermo 26619# Marker电泳后出现9条带：10，15，25，35，55，70，100，130，250KDa（具体条带数目会因为胶的浓度不同而不同），最少4条带（6%的分离胶时出现70，100，130，250KDa）。
（3）电泳：开始恒压，电压80V，电泳跑到分离胶以后可调节电压到120V
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。
电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。
（四）转膜
（1）转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。
将切好的硝酸纤维素膜现在甲醇中浸泡激活，后和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-PVDF膜-2张滤纸-海绵（顺序一定注意）
将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
在垫子上垫二层滤纸，先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。
在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。
（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，故放冰来降温。
一般用恒流400mA转膜1.5-2h。
✧实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应
样本。
转膜后，膜要分正反面，转膜时靠胶的一面为正面。
转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。
如果做磷酸化抗体等，需要用血清封闭，具体情况可参考抗体说明书。
（五）免疫反应
（1）封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1-2h。
（2）一抗
. 将一抗用封闭液稀释至适当浓度；加入抗体， 4度过夜，次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
（3）二抗
同上方法准备二抗稀释液，室温下孵育1-2h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂等量等体积混合；
打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将膜正面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）
（2）将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中；
在红灯下
✧取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；把X－光片放在膜上，一旦放上，便不
能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不
同时间多次压片，以达最佳效果；
✧曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；
✧显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，
从而节约定影液）。
定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；
✧。