western 操作步骤

Western 操作步骤
（三）SDS——PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。

（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边）
2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。

3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。

弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。

4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。

5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。

等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。

6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。

电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。

7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul
（3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。

电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜
（四）转膜
（1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。

切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。

将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。

（2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。

在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回赶几遍以赶走里面的气泡。

在垫子上垫两层滤纸（光滑面临膜），放膜于滤纸上，将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于膜上，用手调整对齐，再放两张滤纸（光滑面临膜）用玻璃棒赶去其中的气泡。

最后盖下另一块海绵垫，擀几下就可以合起来了。

整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路。

如果同时做两块胶，转膜时要记住样本的位置。

（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的红面，夹的白面对槽的黑面。

电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。

一般用35V过夜（刘老师）。

转膜时点击方向注意是膜正胶负转膜结束前配制封闭液（3%脱脂牛奶）及1×TBST缓冲液。

（五）免疫反应
（1）封闭：将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭30分钟。

（2）一抗
A.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min ×4次
B.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1小时后，4度过夜，次日用1×TBST
在室温下脱色摇床上洗4次，每次5分钟。

（3）二抗
二抗稀释液与膜接触，室温下孵育1小时，用1×TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5分钟。

（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂等量（常用各500ul）在5ml离心管仲等体积很合打开X—光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1~3分钟后（见到荧光），用保鲜膜包好。

（2）将1×显影液，自来水和定影液分别倒入盘中：
在红灯下：
A 取出X—光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长宽均大1cm);把X --光片放在膜上，一旦放上，边不能移动，关上X—光片夹，开始计时，根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1到5min,也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。

B 曝光完成后，打开X—光片夹，取出X—光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1~2分钟（20度~25度），温度过低时（低于16度）需延长显影时间。

C 显影结束后，先用自来水洗一下X—光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）。

定影时间一般为5~10分钟，一胶片透明为止; (七）凝胶图像分析；将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。