氨基酸含量测定
实验2 甲醛滴定法测定氨基酸含量
（二）器具
锥形瓶 碱式滴定管 移液管 洗耳球 天平 容量瓶 试剂瓶 量筒 玻棒与烧杯
四、实验操作流程
1、取3只100ml锥形瓶，按下表加入试剂： 锥形瓶编号
试剂
样品1 2.0
5.0 4
样品2 2.0
5.0 2.0 4
空白 —
7.0 2.0 4
1%甘氨酸溶液或样品（ml）
蒸馏水（ml） 中性甲醛溶液（ml） 0.5%酚酞乙醇溶液（滴）
三、材料、试剂与器具
（一）试剂
1、0.5%酚酞酒精溶液：称0.5g酚酞溶于100ml50%酒精中。 2、0.1mol/L甘氨酸溶液：取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。 3、标准0.1mol/L 氢氧化钠溶液 4、中性甲醛溶液：取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂 约3ml，滴加0.1mol/LNaOH溶液，使溶液呈微粉红色， 临用前中和。
六、注意事项
1、严格按分析化学的操作进行。
2、脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不
稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基 结构，导致滴定结果偏高。
思考题：
为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基 上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？
2、混匀后用标准0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微紫(红)色 （pH8.7～9.0），记录每次消耗的标准NaOH体积。
五、实验结果与分析
1、结果计算 每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为： m={（V1-V0)×M标准NaOH×14.008}/2
式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）；
V0为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）； M标准NaOH×14.008为1ml 0.1mol/L氢氧化溶液相当的氮 量（mg）。 2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
02-10-038氨基酸含量的测定-操作步骤(精)
天津现代职业技术学院
3、操作步骤
①．标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。
放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。
（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。
以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
②．氨基酸样品的测定
取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。
放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。
4、将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
- 1 -。
检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论
蛋白质中氨基酸的含量测定组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。
蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，其含量测定是生化药品研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前其常用的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法及荧光法。
1凯氏定氮法1．1方法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以氮转化为蛋白质的换算系数，即为蛋白质的含量。
本法各国药典收载的方法一致。
故参照《中国药典》2005年版三部[41附录方法，按纯蛋白类供试品及添加无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品分别拟定各测定方法。
1．2讨论1．2．1凯氏定氮法虽耗时较长，但它是蛋白质测定方法中最经典的测定方法，本法所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确测定。
1．2．2本法灵敏度较低，适用于O．2～2．o mg氮的测定，干扰少。
1．2．3蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质的含氮量为16％，故含氮量转化为蛋白质的系数为6．25。
但由于不同蛋白质的结构差异，其换算系数会稍有区别，如乳制品为6．38，动物胶为5。
65等，因此一些特殊蛋白质应在各论中相应说吩其转化系数。
1．2．4在本法附注中起草了非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定，一般采用钨酸沉淀法，但当供试品中含有氨基酸(精氨酸)时，由于其会影响蛋白质的沉淀，故建议采用三氯醋酸沉淀法方法(1)与方法(3)的线性相关系数均能达到0．999以上，较理想；方法(1)试剂配制繁琐且整个实验费时长，而方法(3)操作更简便快速。
氨基酸的测定方法
食物中氨基酸的测定方法测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。
一、氨基酸自动分析仪法1.原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。
2.适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。
本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。
其最低检出限为10pmol。
本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3.仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。
用去离子水冲洗干净并烘干。
3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪。
4.试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
4.1浓盐酸：优级纯4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸馏。
4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L4.5缓冲液：4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。
4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
氨基酸含量测定
氨基酸含量测定一、前言氨基酸是构成蛋白质必不可少的基本单位，对于食品、药物等行业来说，氨基酸含量的测定是一项重要的质量控制工作。
氨基酸含量测定可以用于判断蛋白质的含量、质量以及不同品种之间的比较等方面。
因此，本文旨在介绍氨基酸含量测定的原理、方法及其在实际应用中的应用。
二、原理氨基酸含量测定的原理是利用氨基酸的吸光度和该氨基酸与特定试剂的反应，通过测定吸收光度计的吸光度来计算氨基酸的含量。
一般常见的试剂为二氧化硫，根据氧化剂配合体法，氨基酸与二氧化硫反应生成配位物，该配位物具有明显的吸收峰，通过测定这个吸收峰的强度来计算氨基酸的含量。
三、方法1.试剂和仪器试剂：1) 二氧化硫（SO2）2) 酸性亚硫酸钠（NaHSO3）3) 酸性氯化亚铜（CuCl2）溶液4) 氢氧化钠（NaOH）仪器：1) UV-Visible分光光度计2) 恒温取样器3) 小型离心机2.操作步骤样品的制备：1) 将样品细碎并过筛，取适量的样品称入瓶中；2) 加入1ml 6M HCl和氧化氢，使样品完全溶解；3) 将样品续滴2M NaOH至pH7~7.5。
标准溶液制备：将前列腺酸溶液定为含有氨基酸100μg/ml的标准溶液，并用氢氧化钠调至pH7~7.5。
反应溶液的制备：1) 取1ml标准溶液，加入2ml0.1M NaHSO3溶液，均匀混合；2) 加入0.05ml 0.3% w/v CuCl2溶液，混合，并加入2ml3M NaOH；3) 用恒温取样器将反应溶液恒温于37℃。
反应光谱测定：1) 以反应溶液A0的吸光度为零点，在325nm波长处记录各个样品的吸光度；2) 在温度控制下，对反应溶液建立光谱，以每分钟一个波长的扫描模式记录吸光度；3) 在反应6~8分钟时，将反应液离心，将清液移出，并过滤。
数据处理：得到的吸光度值（A）除以样品的光程，得到透过率（T），以此计算出氨基酸的含量。
四、应用氨基酸含量测定对于食品、药物等行业的质量控制非常重要。
甲醛滴定法测定氨基酸含量
实验4 甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、0.5%酚酞酒精溶液称0.5g酚酞溶于100ml60%酒精中。
2、0.05%溴麝香草酚蓝溶液取0.05溴麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、1%甘氨酸溶液取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。
4、标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液5、中性甲本醛溶液取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管1、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤2、混匀后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）3、结果计算每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为12() 1.40082V V mg -⨯= 式中：V 1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml ）；V 2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml ）；1.4008 为1ml 0.1mol/L 氢氧化溶液相当的氮量（mg ）五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
六、实验报告根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。
叶面肥标准—氨基酸含量的测定
1氨基酸含量的测定原理试样用磺基水杨酸沉淀蛋白质后，用EDTA络合金属元素释放氨基酸，各种氨基酸经分离后分别与茚三酮显色，在pH2.2条件下用氨基酸自动分析仪测定各种氨基酸含量，各种氨基酸的总和，即为氨基酸叶面肥料氨基酸的含量。
1.1试剂（1）混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售），0.00250mol/L。
（2）乙二胺四乙酸二钠溶液（EDTA）溶液：1%溶液，称1gEDTA溶于100mL 水中。
（3）磺基水杨酸溶液：称取5g磺基水杨酸溶于100mL水中。
（4）盐酸。
（5）盐酸溶液：0.06mol/L。
（6）氢氧化钠溶液：称取50g氢氧化钠溶于100mL水中。
（7）PH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）和16.5mL盐酸1.1.(4)加水稀释到1000mL，用盐酸和氢氧化钠溶液1.1.（6）调节PH 至2.2。
（8）PH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL盐酸1.1.(4)加水稀释至1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH至3.3。
（9）PH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL盐酸1.1.(4)加水稀释至1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH至4.0。
（10）PH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释至1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH至6.4。
（11）茚三酮溶液：a)PH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiO H〃H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279g，加水稀释到1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH到5.2。
b）茚三酮溶液：称取150mL二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液a）50mL 加4g水合茚三酮（C9H4O 3·H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O 6·2H2O）搅拌至完全溶解。
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
氨基酸的定量测定
6、三硝基苯磺酸法
原理： 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。 TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯 -氨 基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值显著下降，而350nm 附近 的吸收峰则移至340nm 处。 利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性 溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。在 340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度因 2 氨基酸种类而异；在加入适量 SO3 时，吸收值升高。 本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
1、甲醛滴定法
计算结果：
氨基酸态氮含量=
(V2 V1 ) c 0.014 100 % m
式中：c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积， mL m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 1 0.014—— N2毫摩尔质量，g/mmol
100%
式中：VHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的体积 cHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的浓度 M——被测氨基酸的摩尔质量 m——被测氨基酸的质量
4
4、非水溶液滴定法
②回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨 基酸样品30~40mg 左右，溶解于5mL高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩 余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为 终点。 氨基酸含量=
食品中氨基酸总量的测定实验报告
食品中氨基酸总量的测定实验报告氨基酸含量的测定氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：将虾研磨冷却过滤后稀释10倍，吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。
公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100*10式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数；M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象) (6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold 键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。
（一）挥发性盐基氮（TVB-N）的测定半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。
（2）试剂①氧化镁混悬液(10g/L)称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。
氨基酸测定方法
氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，对于生命体的生长和发育起着重要的作用。
因此，准确测定氨基酸的含量和组成对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
本文将介绍一些常用的氨基酸测定方法，包括色谱法、光谱法和化学法等。
二、色谱法测定氨基酸2.1 气相色谱法气相色谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过将氨基酸样品转化为易挥发的衍生物，然后使用气相色谱仪进行分析。
气相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和操作简便等优点。
2.1.1 衍生化反应在气相色谱法中，常用的氨基酸衍生化反应包括酯化、酰化和取代反应等。
这些反应能够将氨基酸转化为易挥发的衍生物，便于后续的气相色谱分析。
2.1.2 气相色谱仪气相色谱仪是进行气相色谱分析的关键设备。
它由进样系统、色谱柱和检测器等部分组成。
进样系统用于将样品引入色谱柱，色谱柱用于分离氨基酸衍生物，检测器用于检测分离后的化合物。
2.2 液相色谱法液相色谱法也是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过将氨基酸样品溶解在溶剂中，然后使用液相色谱仪进行分析。
液相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和选择性强等优点。
2.2.1 色谱柱选择在液相色谱法中，选择合适的色谱柱对于分离氨基酸非常重要。
常用的色谱柱包括离子交换柱、反相柱和手性柱等。
不同的色谱柱具有不同的分离机理和选择性，可以根据需要选择合适的色谱柱。
2.2.2 梯度洗脱条件在液相色谱法中，通过调整洗脱溶剂的组成和流速等参数，可以实现对氨基酸的有效分离。
梯度洗脱条件可以根据氨基酸的亲水性和极性等特性进行优化。
三、光谱法测定氨基酸3.1 紫外-可见光谱法紫外-可见光谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过测量氨基酸在紫外-可见光波段的吸收特性，来推断其含量和组成。
紫外-可见光谱法具有操作简便、灵敏度高和选择性强等优点。
3.1.1 吸收峰特征不同氨基酸在紫外-可见光谱中具有不同的吸收峰特征。
通过测量氨基酸的吸收峰强度和位置，可以推断其含量和组成。
氨基酸的测定方法
氨基酸的测定方法
氨基酸测定就像一场奇妙的科学探险！咱先说说测定方法的步骤吧。
首先得准备样品，这就好比做饭前要准备食材一样重要。
把样品处理得妥妥当当，不能有半点马虎。
然后选择合适的测定方法，有化学分析法、色谱法等等。
这就像在众多工具中挑选最顺手的那一个，可不能瞎选。
接着进行实验操作，仔细观察数据变化，就像侦探在寻找线索一样。
那注意事项呢？哎呀，这可不少。
样品处理一定要规范，不然结果肯定不靠谱。
实验过程中要严格控制条件，稍有差池就可能前功尽弃。
就好比走钢丝，得小心翼翼，一步都不能错。
再说说安全性和稳定性。
在测定过程中，一定要确保安全，不能有任何危险。
就像开车要系安全带一样，这是必须的。
稳定性也很重要，要是结果一会儿一个样，那还得了？这就像建房子，得稳稳当当的，不能摇摇晃晃。
应用场景那可多了去了。
在食品行业，可以检测食品中的氨基酸含量，确保食品的营养和安全。
在医药行业，能帮助研发新药，治疗疾病。
这就像一把万能钥匙，可以打开很多扇门。
优势也很明显啊，准确、快速、灵敏。
这就像一个超级侦探，能迅速找到答案。
举个实际案例吧。
有一家食品公司，通过氨基酸测定，发现了产品中的问题，及时进行了改进，提高了产品质量。
这效果，杠杠的！就像给病人吃了良药，一下子就好了。
我的观点结论就是：氨基酸测定方法超级棒！它能为我们的生活带来很多好处，大家一定要好好利用它。
氨基酸分析仪法测定氨基酸含量
• 评价作物的营养品质，指导作物育种和栽培
• 检测农作物中的氨基酸代谢产物，研究作物生长和抗逆性
检测农业生产中的肥料和饲料
• 测定肥料和饲料中的氨基酸含量，评估肥料和饲料的营养价值
• 检测肥料和饲料中的氨基酸代谢产物，评估肥料和饲料的使用效果
谢谢观看
THANK YOU FOR WATCHING
• 通过输液泵和色谱柱实现氨基酸的分离
• 使用检测器检测氨基酸的荧光或紫外吸收信号
⌛️
数据处理
• 使用计算机和软件处理实验数据
• 计算氨基酸的含量和相对含量
• 生成实验报告，总结实验结果
03
氨基酸分析仪法的实验操作
样品前处理及氨基酸提取
样品前处理
氨基酸提取
• 研磨样品，使其均匀分散
• 使用醋酸钠或醋酸铵溶液沉淀氨基酸
氨基酸分析仪法在食品检测中的应用
测定食品中的氨基酸含量
检测食品中的食品添加剂
• 评价食品的营养价值，指导食品配方和加工
• 测定食品添加剂中的氨基酸含量，评估食品添加剂的安
• 检测食品中的氨基酸代谢产物，评估食品的新鲜度和品
全性
质
• 检测食品添加剂中的氨基酸代谢产物，评估食品添加剂
的使用效果
氨基酸分析仪法在生物医药领域的应用
谢产物，评估食品的新鲜
度和品质
农业领域
• 测定农作物中的氨基酸
生物医药领域
含量，评价作物的营养品
质
• 检测农作物中的氨基酸
代谢产物，研究作物生长
和抗逆性
• 测定生物体液中的氨基
酸含量，评价生理功能和
疾病状态
• 检测生物组织中的氨基
(整理)氨基酸含量的测定
氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0 ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：将虾研磨冷却过滤后稀释10倍，吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。
公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100*10式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数；M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象)(6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。
（一）挥发性盐基氮（TVB-N）的测定半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。
（2）试剂①氧化镁混悬液(10g/L) 称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。
氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量可以用不同的方法进行测定，以下是其中几种常用的方法：
1. 紫外吸收法（UV法）：氨基酸分子中存在芳香族环和烯烃键，可以吸收紫外光，根据吸收的强度来确定氨基酸的浓度。
2. 高效液相色谱法（HPLC法）：这是一种常用的测定氨基酸含量的方法，通过将样品中的氨基酸溶解后注入液相色谱仪中，利用氨基酸在不同条件下的保留时间和峰面积来测定其含量。
3. 伯里特法：伯里特试剂能与氨基酸发生比色反应，该方法适用于测定含有酪蛋白、皮质素等色泽较重的氨基酸的含量。
4. 显色法：该方法将氨基酸和特定试剂反应，生成显色产物，根据产物的颜色深浅来测定氨基酸含量。
常用的显色试剂有二。
甲醛滴定法测定氨基酸含量
实验4甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的竣基。
甲醛可与氨基酸上的TOL结合，形成一NH-CHQH、一N(CH L OH)：等疑甲基衍生物，使2乩上的H•游离出来，这样就可以用碱滴定冋3放出测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸(如蛋白质水解液)，测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具(―*)试剂1、％酚酿酒精溶液称酚瞅溶于100ml60%酒精中。
2、％溟麝香草酚蓝溶液取澳麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、1%甘氨酸溶液取lg甘氨酸溶于100ml蒸饰水。
4、标准L氢氧化钠溶液5、中性甲本醛溶液取甲醛溶液50ml,力嗎酚酿指示剂约3ml,滴加LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管1、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤1、取3只100ml锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准L氢氧化钠溶液滴定至紫色（〜）3、结果计算每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为(V-K)x 1.4008吨= --- ---- "3 -----式中：百为滴定样品消耗氢氧化钠的体积(ml)；也为滴空白消耗氢氧化钠的体积(ml)；为lml L氢氧化溶液相当的氮量(mg)五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
六、实验报告根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。
，七、思考题1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么/2、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的一2乩基上的H',不能用一般的酸碱指示剂。
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茚三酮比色测定氨基酸含量
一、实验原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm,故据此可以测定
样品中氨基酸含量。
二、实验试剂
（1） 1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（Sn。
2?出0）,搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：
I、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
U、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶
解后，定量转入500mL 容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
川、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均
匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL 容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200卩g/mL 氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤
（ 1 ）标准曲线绘制
准确吸取200卩g/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600卩g氨基酸），分别置于25mL容
量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）
和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90C水浴上加热至显色恒
定为止（该加热过程至少需要25 分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为
参比液测定其余各溶液的吸光度 A ;若生成的化合物呈黄色，则在350nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
图1 350nm波长下氨基酸与吸光度线性关系图（雷恩，2016）（2）提取样品
称取1.0-2.0g植物样品（新鲜样或干样），加5mL 10%醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入100mL容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
该样品提取液可继续用来测定可溶性蛋白质含量（考马斯亮蓝G-250法）
（3）样品测定
吸取澄清的样品溶液4mL,按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。
（4）结果计算
____ ——-——x 100
氨基酸含量（卩g /1oog =
式中：
C—从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，卩g
m—测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
四、说明及注意事项
（1）茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，
使用前须进行纯化，方法如下：取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1分钟，静置30 分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过
100 200 300 400 500 600 700
氨基酸含量/⑷
1
a
y= 0.000935X + 0.002679
6
a
o o o o 5 4 3 2 a a a a 值度光
滤，用2mL 冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。
（2）应控制反应溶液的pH 才能得到重现性好的结果，反应液pH 在 6.2 - 6.4 之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2:1 或1:1。
（3）要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。
沸水
浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度（80C）,延长
加热时间，使发色均匀。
也可以在烘箱中加热，105C烘10分钟。
（4）茚三酮与氨基酸反应生成的颜色在 1 小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。
（5）明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸（酪氨酸等）也被活性炭吸附，会使结果降低。
（6）茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。
（7）植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理。